Bộ phát hiện kháng thể trung hòa SARS-CoV-2 (ELISA)
【NGUYÊN TẮC】
Bộ phát hiện kháng thể trung hòa SARS-CoV-2 dựa trên phương pháp ELISA cạnh tranh.
Sử dụng miền liên kết thụ thể tinh khiết (RBD), protein từ protein tăng đột biến của virus và tế bào chủ
thụ thể ACE2, xét nghiệm này được thiết kế để bắt chước sự tương tác trung hòa của virus-host.
Máy hiệu chuẩn, kiểm soát chất lượng và các mẫu huyết thanh hoặc huyết tương được trộn đều trong pha loãng
Bộ đệm chứa liên hợp HACE2-HRP được phân phối trong các ống nhỏ. Sau đó các hỗn hợp được chuyển vào
Các giếng vi mô có chứa đoạn RBD SARS-CoV-2-2 không cố định (RBD) cho
ủ bệnh. Trong thời gian ủ 30 phút, kháng thể đặc hiệu RBD trong các bộ hiệu chuẩn, QC và
Các mẫu sẽ cạnh tranh với HACE2-HRP để liên kết cụ thể RBD bất động trong các giếng. Sau đó
Việc ủ, các giếng được rửa 4 lần để loại bỏ liên hợp HACE2-HRP không liên kết. Một giải pháp của
TMB sau đó được thêm và ủ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng, dẫn đến sự phát triển của
Màu xanh. Sự phát triển màu được dừng lại với việc bổ sung 1n HCl, và độ hấp thụ là
đo quang phổ ở 450nm. Cường độ của màu được hình thành tỷ lệ thuận với
Lượng enzyme hiện tại, và có liên quan nghịch đảo đến số lượng tiêu chuẩn được thử nghiệm theo cùng một cách.
Thông qua so sánh với đường cong hiệu chuẩn được hình thành bởi các bộ hiệu chuẩn được cung cấp, nồng độ của
Các kháng thể trung hòa trong mẫu chưa biết sau đó được tính toán.
【Vật liệu cần thiết nhưng không được cung cấp】
1. Nước cất hoặc khử ion
2. Các đường ống chính xác: 10μl, 100μl, 200μl và 1 ml
3. Mẹo pipet dùng một lần
4. Đầu đọc vi bản có khả năng đọc độ hấp thụ ở 450nm.
5. Giấy hấp thụ
6. Biểu đồ giấy
7. Máy trộn xoáy hoặc tương đương
【Bộ sưu tập và lưu trữ mẫu vật】
1. Các mẫu huyết thanh và huyết tương được thu thập trong các ống chứa K2-EDTA có thể được sử dụng cho bộ này.
2. Mẫu vật nên được giới hạn và có thể được lưu trữ trong tối đa 48 giờ ở 2 ° C - 8 ° C trước khi xét nghiệm.
Mẫu vật được giữ trong một thời gian dài hơn (tối đa 6 tháng) chỉ nên bị đóng băng một lần ở -20 ° C trước khi xét nghiệm.
Tránh các chu kỳ đóng băng lặp đi lặp lại.
Giao thức
【Chuẩn bị thuốc thử】
1. Tất cả các thuốc thử phải được lấy ra khỏi điện lạnh và được phép trở về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng
(20 ° đến 25 ° C). Lưu tất cả các thuốc thử trong tủ lạnh kịp thời sau khi sử dụng.
2. Tất cả các mẫu và điều khiển nên được xoáy trước khi sử dụng.
3. Chuẩn bị giải pháp HACE2-HRP: Pha loãng HACE2-HRP cô đặc ở tỷ lệ pha loãng 1: 51
Bộ đệm. Ví dụ, pha loãng 100 μl HACE2-HRP cô đặc với 5,0ml dung dịch đệm pha loãng HRP thành
Tạo một giải pháp HACE2-HRP.
4. Chuẩn bị dung dịch 1 × rửa: Pha loãng dung dịch rửa 20 × với nước khử ion hoặc cất
Tỷ lệ khối lượng của 1:19. Ví dụ, pha loãng 20 ml dung dịch rửa 20 × với 380 ml khử ion hoặc
Nước cất để tạo 400 ml dung dịch rửa 1 ×.
【Thủ tục kiểm tra】
1. Trong các ống riêng biệt, Aliquot 120μl dung dịch HACE2-HRP đã chuẩn bị.
2. Thêm 6 μl các máy hiệu chuẩn, các mẫu không xác định, điều khiển chất lượng trong mỗi ống và trộn đều.
3. Chuyển 100μL mỗi hỗn hợp được điều chế trong bước 2 vào các giếng vi mô tương ứng theo
Để cấu hình kiểm tra được thiết kế trước.
3
4. Tháo chất bịt kín tấm và rửa tấm bằng khoảng 300 μl dung dịch rửa 1 × mỗi giếng trong bốn lần.
5. Nhấn vào tấm trên khăn giấy để loại bỏ chất lỏng còn lại trong giếng sau khi rửa các bước.
6. Thêm 100 μl dung dịch TMB cho mỗi giếng và ủ tấm trong bóng tối ở 20 - 25 ° C trong 20 phút.
7. Thêm 50 μl dung dịch dừng cho mỗi giếng để dừng phản ứng.
8. Đọc độ hấp thụ trong đầu đọc vi bản
được đề xuất cho hiệu suất chính xác cao hơn).