Bộ phát hiện kháng thể trung hòa SARS-CoV-2 (ELISA)
【NGUYÊN TẮC】
Bộ phát hiện kháng thể trung hòa SARS-CoV-2 dựa trên phương pháp ELISA cạnh tranh.
Sử dụng miền liên kết thụ thể (RBD) đã được tinh chế, protein từ protein gai (S) của virus và tế bào chủ
thụ thể ACE2, xét nghiệm này được thiết kế để mô phỏng sự tương tác trung hòa virus-vật chủ.
Chất hiệu chuẩn, Chất kiểm soát Chất lượng và mẫu huyết thanh hoặc huyết tương được trộn đều theo độ pha loãng
đệm chứa liên hợp hACE2-HRP được chia thành từng ống nhỏ. Sau đó hỗn hợp được chuyển vào
các giếng vi đĩa chứa đoạn RBD tái tổ hợp cố định (RBD) của SARS-CoV-2 để
ủ bệnh. Trong thời gian ủ 30 phút, kháng thể đặc hiệu RBD trong các chất hiệu chuẩn, QC và
các mẫu sẽ cạnh tranh với hACE2-HRP để gắn kết đặc hiệu với RBD cố định trong giếng. Sau đó
ủ, các giếng được rửa 4 lần để loại bỏ liên hợp hACE2-HRP không liên kết. Một giải pháp của
TMB sau đó được thêm vào và ủ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng, dẫn đến sự phát triển của
màu xanh. Sự phát triển màu sắc dừng lại khi thêm HCl 1N và độ hấp thụ là
được đo bằng quang phổ ở bước sóng 450 nm. Cường độ của màu được hình thành tỷ lệ thuận với
lượng enzyme có mặt và tỷ lệ nghịch với lượng chất chuẩn được phân tích theo cách tương tự.
Thông qua so sánh với đường cong hiệu chuẩn được hình thành bởi các chất hiệu chuẩn được cung cấp, nồng độ của
Sau đó tính toán các kháng thể trung hòa trong mẫu chưa biết.
【VẬT LIỆU YÊU CẦU NHƯNG KHÔNG CUNG CẤP】
1. Nước cất hoặc nước khử ion
2. Pipet chính xác: 10μL, 100μL, 200μL và 1 mL
3. Đầu tip pipet dùng một lần
4. Đầu đọc vi bản có khả năng đọc độ hấp thụ ở bước sóng 450nm.
5. Giấy thấm
6. Giấy vẽ đồ thị
7. Máy trộn xoáy hoặc tương đương
【THU THẬP VÀ LƯU TRỮ MẪU】
1. Có thể sử dụng các mẫu huyết thanh và huyết tương được thu thập trong các ống chứa K2-EDTA cho bộ sản phẩm này.
2. Mẫu phải được đậy nắp và có thể bảo quản tối đa 48 giờ ở nhiệt độ 2°C - 8°C trước khi xét nghiệm.
Mẫu được giữ trong thời gian dài hơn (tối đa 6 tháng) chỉ nên được đông lạnh một lần ở -20°C trước khi xét nghiệm.
Tránh lặp đi lặp lại các chu kỳ đóng băng-tan băng.
GIAO THỨC
【Chuẩn bị thuốc thử】
1. Tất cả thuốc thử phải được lấy ra khỏi tủ lạnh và để trở về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng
(20° đến 25°C). Bảo quản tất cả thuốc thử trong tủ lạnh ngay sau khi sử dụng.
2. Tất cả các mẫu và chất đối chứng phải được xoáy trước khi sử dụng.
3. Chuẩn bị dung dịch hACE2-HRP: Pha loãng hACE2-HRP đậm đặc theo tỷ lệ pha loãng 1:51 bằng Pha loãng
Bộ đệm. Ví dụ: pha loãng 100 μL chất cô đặc hACE2-HRP với 5,0mL Dung dịch đệm pha loãng HRP để
tạo ra giải pháp hACE2-HRP.
4. Chuẩn bị dung dịch rửa 1×: Pha loãng dung dịch rửa 20× bằng nước khử ion hoặc nước cất bằng
tỷ lệ thể tích 1:19. Ví dụ, pha loãng 20 mL dung dịch rửa 20× với 380 mL dung dịch khử ion hoặc
nước cất để tạo thành 400 mL dung dịch rửa 1×.
【Quy trình kiểm tra】
1. Trong các ống riêng biệt, lấy 120μL dung dịch hACE2-HRP đã chuẩn bị.
2. Thêm 6 µL chất hiệu chuẩn, mẫu chưa biết, chất kiểm soát chất lượng vào mỗi ống và trộn đều.
3. Chuyển 100μL mỗi hỗn hợp đã chuẩn bị ở bước 2 vào các giếng vi đĩa tương ứng theo
đến cấu hình thử nghiệm được thiết kế trước.
3. Đậy đĩa bằng Plate Sealer và ủ ở 37°C trong 30 phút.
4. Tháo Tấm bịt kín và rửa đĩa với khoảng 300 μL Dung dịch Rửa 1× mỗi giếng trong bốn lần.
5. Gõ đĩa lên khăn giấy để loại bỏ chất lỏng còn sót lại trong giếng sau các bước rửa.
6. Thêm 100 µL dung dịch TMB vào mỗi giếng và ủ đĩa ở nơi tối ở 20 - 25°C trong 20 phút.
7. Thêm 50 µL dung dịch dừng vào mỗi giếng để dừng phản ứng.
8. Đọc độ hấp thụ trong đầu đọc vi bản ở bước sóng 450 nm trong vòng 10 phút (630nm đối với phụ kiện là
được khuyến nghị để có hiệu suất chính xác cao hơn).