SARS-CoV-2 neytrallashtiruvchi antikorlarni aniqlash to'plami (ELISA)
【PRINSIP】
SARS-CoV-2 neytrallashtiruvchi antikorlarni aniqlash to'plami raqobatbardosh Elishay metodologiyasiga asoslangan.
Tozalangan retseptorlarni bog'lovchi domen (RBD), virusli boshoq (S) oqsilidan va xost hujayradan olingan oqsildan foydalanish
retseptorlari ACE2, bu test virus-xost neytrallashtiruvchi o'zaro ta'sirini taqlid qilish uchun mo'ljallangan.
Kalibratorlar, sifat nazorati va sarum yoki plazma namunalari alohida-alohida suyultirishda yaxshilab aralashtiriladi
kichik naychalarga ajratilgan hACE2-HRP konjugatini o'z ichiga olgan bufer. Keyin aralashmalar ichkariga o'tkaziladi
uchun immobilizatsiyalangan rekombinant SARS-CoV-2 RBD fragmentini (RBD) o'z ichiga olgan mikroplastinka quduqlari
inkubatsiya. 30 daqiqalik inkubatsiya davomida kalibratorlardagi RBDga xos antikor, QC va
namunalar quduqlarda immobilizatsiya qilingan RBDni maxsus bog'lash uchun hACE2-HRP bilan raqobatlashadi. Keyin
inkubatsiya, quduqlar bog'lanmagan hACE2-HRP konjugatini olib tashlash uchun 4 marta yuviladi. ning yechimi
Keyin TMB qo'shiladi va xona haroratida 20 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi, natijada a
ko'k rang. Rang rivojlanishi 1N HCl qo'shilishi bilan to'xtatiladi va absorbans bo'ladi
450 nm da spektrofotometrik tarzda o'lchandi. Hosil bo'lgan rangning intensivligi bilan proportsionaldir
mavjud bo'lgan ferment miqdori va xuddi shu tarzda tahlil qilingan standartlar miqdori bilan teskari bog'liqdir.
Taqdim etilgan kalibratorlar tomonidan tuzilgan kalibrlash egri chizig'i bilan taqqoslash orqali, ning konsentratsiyasi
keyin noma'lum namunadagi neytrallashtiruvchi antikorlar hisoblab chiqiladi.
【TALAB QILGAN MATERIALLAR, BIRINCHA TAQDIM ETILMAGAN】
1. Distillangan yoki deionizatsiyalangan suv
2. Nozik pipetkalar: 10 mkl, 100 mkl, 200 mkl va 1 ml
3. Bir marta ishlatiladigan pipetka uchlari
4. 450 nm da absorbansni o'qishga qodir mikroplastinka o'quvchi.
5. Absorbent qog'oz
6. Grafik qog'oz
7. Vorteks mikser yoki ekvivalenti
【NAMUNA TO'PLASH VA SAQLASH】
1. K2-EDTA o'z ichiga olgan naychalarda to'plangan sarum va plazma namunalari ushbu to'plam uchun ishlatilishi mumkin.
2. Namunalar yopilishi kerak va tahlil qilishdan oldin 2 °C - 8 °C haroratda 48 soatgacha saqlanishi mumkin.
Uzoq vaqt davomida (6 oygacha) saqlanadigan namunalar tahlildan oldin faqat bir marta -20 °C da muzlatilishi kerak.
Qayta-qayta muzlatish-eritish davrlaridan saqlaning.
PROTOKOL
【Reaktiv tayyorlash】
1. Barcha reagentlar muzlatgichdan olib tashlanishi va ishlatishdan oldin xona haroratiga qaytishi kerak
(20° dan 25°C gacha). Foydalanishdan keyin barcha reagentlarni darhol muzlatgichda saqlang.
2. Foydalanishdan oldin barcha namunalar va nazoratlar vortekslanishi kerak.
3. hACE2-HRP eritmasini tayyorlash: hACE2-HRP konsentratini 1:51 nisbatda suyultirish bilan suyultiring.
Bufer. Masalan, 100 mL hACE2-HRP konsentratini 5,0 ml HRP suyultirish buferi bilan suyultiring.
hACE2-HRP eritmasini tayyorlang.
4. 1 × yuvish eritmasini tayyorlash: 20 × yuvish eritmasini deionizatsiyalangan yoki distillangan suv bilan suyultiring.
ovoz balandligi nisbati 1:19. Masalan, 20 ml 20 × yuvish eritmasini 380 ml deionlangan yoki
400 ml 1 × yuvish eritmasini tayyorlash uchun distillangan suv.
【Sinov tartibi】
1. Alohida naychalarga 120 mkl tayyorlangan hACE2-HRP eritmasidan alikot tushiring.
2. Har bir naychaga 6 mkL kalibratorlar, noma'lum namunalar, sifat nazorati qo'shing va yaxshilab aralashtiring.
3. 2-bosqichda tayyorlangan har bir aralashmaning 100 mkl dan mikroplastinkaning mos keladigan quduqlariga o'tkazing.
oldindan ishlab chiqilgan test konfiguratsiyasiga.
3. Plitani Plate Sealer bilan yoping va 37°C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.
4. Plitalar yopishtirgichni olib tashlang va plastinkani har bir quduqqa taxminan 300 mL 1× yuvish eritmasi bilan to'rt marta yuving.
5. Yuvish bosqichlaridan keyin quduqlardagi qoldiq suyuqlikni olib tashlash uchun plastinkani qog'oz sochiq ustiga bosing.
6. Har bir quduqqa 100 mkl TMB eritmasi qo'shing va plastinkani qorong'i joyda 20-25°C da 20 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.
7. Reaksiyani to'xtatish uchun har bir quduqqa 50 mL to'xtatuvchi eritma qo'shing.
8. Mikroplastinka o'quvchida 450 nm chastotada 10 daqiqa ichida absorbansni o'qing (aksessuar sifatida 630 nm)
yuqori aniqlikdagi ishlash uchun tavsiya etiladi).