SARS-CoV-2 نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈی ڈیٹیکشن کٹ (ELISA)
【اصول】
SARS-CoV-2 نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈی ڈیٹیکشن کٹ مسابقتی ELISA طریقہ کار پر مبنی ہے۔
پیوریفائیڈ ریسیپٹر بائنڈنگ ڈومین (RBD) کا استعمال کرتے ہوئے، وائرل سپائیک (S) پروٹین اور میزبان سیل سے پروٹین
ریسیپٹر ACE2، یہ ٹیسٹ وائرس کے میزبان کو بے اثر کرنے والے تعامل کی نقل کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔
کیلیبریٹرز، کوالٹی کنٹرول، اور سیرم یا پلازما کے نمونے انفرادی طور پر اچھی طرح مکس کیے جاتے ہیں
HACE2-HRP کنجوگیٹ پر مشتمل بفر چھوٹی ٹیوبوں میں الگ کیا گیا ہے۔اس کے بعد مرکب کو منتقل کیا جاتا ہے
مائکروپلیٹ کنویں جن میں غیر متحرک ریکومبیننٹ SARS-CoV-2 RBD فریگمنٹ (RBD) کے لیے
انکیوبیشن30 منٹ کے انکیوبیشن کے دوران، کیلیبریٹرز میں RBD مخصوص اینٹی باڈی، QC اور
نمونے کنوؤں میں متحرک RBD کی مخصوص پابندی کے لیے hACE2-HRP کا مقابلہ کریں گے۔کے بعد
انکیوبیشن کے دوران، کنوئیں کو 4 بار دھویا جاتا ہے تاکہ غیر پابند hACE2-HRP کنجوگیٹ کو ہٹایا جا سکے۔کا ایک حل
اس کے بعد TMB کو شامل کیا جاتا ہے اور کمرے کے درجہ حرارت پر 20 منٹ تک انکیوبیٹ کیا جاتا ہے، جس کے نتیجے میں a
نیلا رنگ.1N HCl کے اضافے کے ساتھ رنگ کی نشوونما روک دی جاتی ہے، اور جذب ہوتا ہے۔
450 nm پر سپیکٹرو فوٹومیٹرک طور پر ماپا گیا۔تشکیل شدہ رنگ کی شدت متناسب ہے۔
انزائم کی مقدار موجود ہے، اور اسی طرح پرکھے گئے معیارات کی مقدار سے الٹا تعلق رکھتی ہے۔
فراہم کردہ کیلیبریٹرز کے ذریعہ تشکیل کردہ انشانکن منحنی خطوط کے ساتھ موازنہ کے ذریعے، کا ارتکاز
پھر نامعلوم نمونے میں اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنے کا حساب لگایا جاتا ہے۔
【مواد درکار ہے لیکن فراہم نہیں کیا گیا۔】
1. آست یا ڈیونائزڈ پانی
2. صحت سے متعلق پائپیٹس: 10μL، 100μL، 200μL اور 1 mL
3. ڈسپوزایبل پپیٹ ٹپس
4. مائکروپلیٹ ریڈر 450nm پر جاذب کو پڑھنے کے قابل ہے۔
5. جاذب کاغذ
6. گراف پیپر
7. ورٹیکس مکسر یا اس کے مساوی
【نمونوں کا مجموعہ اور ذخیرہ】
1. اس کٹ کے لیے K2-EDTA والی ٹیوبوں میں جمع کیے گئے سیرم اور پلازما کے نمونے استعمال کیے جا سکتے ہیں۔
2. نمونوں کو 2 ° C - 8 ° C پر پرکھنے سے پہلے 48 گھنٹے تک محفوظ کیا جانا چاہئے۔
لمبے عرصے تک (6 ماہ تک) رکھے گئے نمونوں کو پرکھ سے پہلے صرف ایک بار -20 ° C پر منجمد کیا جانا چاہئے۔
بار بار منجمد پگھلنے کے چکروں سے بچیں۔
پروٹوکول
【ریجنٹ کی تیاری】
1. تمام ریجنٹس کو ریفریجریشن سے نکالنا چاہیے اور استعمال کرنے سے پہلے کمرے کے درجہ حرارت پر واپس جانے دیا جانا چاہیے۔
(20 ° سے 25 ° C)استعمال کے فوراً بعد تمام ری ایجنٹس کو ریفریجریٹر میں محفوظ کریں۔
2. استعمال سے پہلے تمام نمونوں اور کنٹرولوں کو گھمایا جانا چاہیے۔
3. hACE2-HRP حل کی تیاری: HACE2-HRP کی توجہ کو 1:51 پر dilution کے تناسب سے پتلا کریں۔
بفر۔مثال کے طور پر، 100 μL hACE2-HRP کے ارتکاز کو 5.0mL HRP Dilution Buffer کے ساتھ پتلا کریں۔
ایک hACE2-HRP حل بنائیں۔
4. 1× واش سلوشن کی تیاری: 20× واش سلوشن کو ڈیونائزڈ یا ڈسٹل واٹر کے ساتھ پتلا کریں۔
حجم کا تناسب 1:19۔مثال کے طور پر، 20 ملی لیٹر 20× واش سلوشن کو 380 ملی لیٹر ڈیونائزڈ یا کے ساتھ پتلا کریں۔
400 ملی لیٹر 1× واش سلوشن بنانے کے لیے آست پانی۔
【ٹیسٹ کا طریقہ کار】
1. علیحدہ ٹیوبوں میں، تیار کردہ hACE2-HRP محلول کا ایلی کوٹ 120μL۔
2. ہر ٹیوب میں 6 μL کیلیبریٹر، نامعلوم نمونے، کوالٹی کنٹرول شامل کریں اور اچھی طرح مکس کریں۔
3. مرحلہ 2 میں تیار کردہ ہر مکسچر کا 100μL اس کے مطابق مائیکرو پلیٹ کنوؤں میں منتقل کریں۔
پہلے سے ڈیزائن کردہ ٹیسٹ کنفیگریشن کے لیے۔
3. پلیٹ کو پلیٹ سیلر سے ڈھانپیں اور 37 ° C پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔
4. پلیٹ سیلر کو ہٹائیں اور پلیٹ کو تقریباً 300 μL 1× واش سلوشن فی کنویں کے ساتھ چار بار دھو لیں۔
5. قدموں کو دھونے کے بعد کنوؤں میں موجود بقایا مائع کو ہٹانے کے لیے پلیٹ کو کاغذ کے تولیے پر تھپتھپائیں۔
6. ہر کنویں میں 100 μL TMB محلول شامل کریں اور پلیٹ کو اندھیرے میں 20 - 25 ° C پر 20 منٹ تک سینکیں۔
7. رد عمل کو روکنے کے لیے ہر کنویں میں 50 μL سٹاپ سلوشن شامل کریں۔
8. مائکروپلیٹ ریڈر میں جاذبیت کو 10 منٹ کے اندر 450 nm پر پڑھیں (630nm بطور لوازمات
اعلی صحت سے متعلق کارکردگی کے لئے تجویز کردہ)۔
