سارس-کوف -2 اینٹی باڈی کا پتہ لگانے والی کٹ (ELISA)
【اصول】
SARS-COV-2 غیر جانبدار اینٹی باڈی کا پتہ لگانے والی کٹ مسابقتی ELISA کے طریقہ کار پر مبنی ہے۔
صاف شدہ رسیپٹر بائنڈنگ ڈومین (آر بی ڈی) کا استعمال ، وائرل اسپائک (ایس) پروٹین اور میزبان سیل سے پروٹین
رسیپٹر ACE2 ، یہ ٹیسٹ وائرس کے میزبان غیر جانبدارانہ تعامل کی نقل کرنے کے لئے ڈیزائن کیا گیا ہے۔
کیلیبریٹرز ، کوالٹی کنٹرول ، اور سیرم یا پلازما کے نمونے انفرادی طور پر کمزوری میں اچھی طرح سے مل جاتے ہیں
چھوٹے نلکوں میں HACE2-HRP کنجوجٹ پر مشتمل بفر۔ پھر مرکب میں منتقل کردیئے جاتے ہیں
مائکروپلیٹ کنوؤں پر مشتمل ہے جس میں متحرک ریکومبیننٹ سارس-سی او وی 2 آر بی ڈی ٹکڑے (آر بی ڈی) پر مشتمل ہے
انکیوبیشن 30 منٹ کی انکیوبیشن کے دوران ، کیلیبریٹرز ، کیو سی میں آر بی ڈی مخصوص اینٹی باڈی
کنوؤں میں متحرک آر بی ڈی کو مخصوص پابند کرنے کے لئے نمونے HACE2-HRP کے ساتھ مقابلہ کریں گے۔ کے بعد
انکیوبیشن ، کنوؤں کو 4 بار دھویا جاتا ہے تاکہ ان باؤنڈ HACE2-HRP کنجوجٹ کو دور کیا جاسکے۔ کا ایک حل
اس کے بعد ٹی ایم بی کو شامل کیا جاتا ہے اور کمرے کے درجہ حرارت پر 20 منٹ تک انکیوبیٹ کیا جاتا ہے ، جس کے نتیجے میں ایک کی ترقی ہوتی ہے
نیلے رنگ کا رنگ۔ 1N HCl کے اضافے کے ساتھ رنگ کی نشوونما روک دی گئی ہے ، اور جاذب ہے
450 ینیم پر سپیکٹرو فوٹومیٹرک پیمائش کی گئی۔ تشکیل شدہ رنگ کی شدت کے متناسب ہے
انزائم کی مقدار موجود ہے ، اور اسی طرح سے معاون معیارات کی مقدار سے الٹا تعلق ہے۔
فراہم کردہ کیلیبریٹرز کے ذریعہ تشکیل دیئے گئے انشانکن وکر کے ساتھ موازنہ کے ذریعے ، حراستی
اس کے بعد نامعلوم نمونے میں اینٹی باڈیز کو غیر جانبدار کرنے کا حساب لگایا جاتا ہے۔
【مواد کی ضرورت ہے لیکن فراہم نہیں کی گئی ہے】
1. آست یا deionized پانی
2. صحت سے متعلق پائپٹس: 10μl ، 100μl ، 200μl اور 1 ملی لیٹر
3. ڈسپوز ایبل پائپٹ ٹپس
4. مائکروپلیٹ ریڈر 450Nm پر جاذب پڑھنے کے قابل ہے۔
5. جاذب کاغذ
6. گراف پیپر
7. ورٹیکس مکسر یا مساوی
【نمونہ جمع کرنے اور اسٹوریج】
1۔ سیرم اور پلازما کے نمونے جو کے 2 ای ڈی ٹی اے پر مشتمل نلیاں میں جمع کیے گئے ہیں اس کٹ کے لئے استعمال کیا جاسکتا ہے۔
2. نمونوں کو محدود کیا جانا چاہئے اور اس سے پہلے کہ 48 گھنٹوں تک 2 ° C - 8 ° C پر ادائیگی کی جاسکتی ہے۔
طویل عرصے تک (6 ماہ تک) نمونوں کو پرکھ سے پہلے صرف ایک بار -20 ° C پر منجمد کیا جانا چاہئے۔
بار بار منجمد کرنے کے چکروں سے پرہیز کریں۔
پروٹوکول
【ریجنٹ تیاری】
1۔ تمام ریجنٹس کو ریفریجریشن سے باہر نکالا جانا چاہئے اور استعمال سے پہلے کمرے کے درجہ حرارت پر واپس جانے کی اجازت دی جانی چاہئے
(20 ° سے 25 ° C) استعمال کے بعد فوری طور پر ریفریجریٹر میں موجود تمام ریجنٹس کو بچائیں۔
2. استعمال سے پہلے تمام نمونے اور کنٹرولوں کو بھنور ہونا چاہئے۔
3. HACE2-HRP حل کی تیاری: HACE2-HRP کو کم کریں
بفر مثال کے طور پر ، HACE2-HRP کے 100 μl کو HRP dilution بفر کے 5.0 ملی لیٹر کے ساتھ کم کریں
HACE2-HRP حل بنائیں۔
4. 1 × واش حل کی تیاری: 20 × واش حل کو deionized یا آست پانی کے ساتھ ایک کے ساتھ کمزور کریں
حجم کا تناسب 1:19۔ مثال کے طور پر ، 380 ملی لیٹر کے ساتھ 20 × واش حل 20 ملی لیٹر کو کمزور کریں یا
1 × واش حل کا 400 ملی لیٹر بنانے کے لئے آست پانی۔
【ٹیسٹ کا طریقہ کار】
1. علیحدہ ٹیوبوں میں ، تیار شدہ HACE2-HRP حل کے ایلیکوٹ 120μl۔
2. ہر ٹیوب میں 6 μl کیلیبریٹرز ، نامعلوم نمونے ، معیار کے کنٹرول شامل کریں اور اچھی طرح مکس کریں۔
3. مرحلہ 2 میں تیار کردہ ہر مرکب کے 100μl کو اسی مائکروپلیٹ کنوؤں میں منتقل کریں کے مطابق
پہلے سے تیار کردہ ٹیسٹ ترتیب کو۔
3. پلیٹ کو پلیٹ سیلر سے ڈھانپیں اور 30 منٹ کے لئے 37 ° C پر انکیوبیٹ کریں۔
4. پلیٹ سیلر کو ہٹا دیں اور پلیٹ کو تقریبا 300 300 μl 1 × l کے ساتھ دھوئے ہر اچھی طرح سے چار بار۔
5. قدم دھونے کے بعد کنوؤں میں بقایا مائع کو دور کرنے کے لئے کاغذ کے تولیہ پر پلیٹ کو تھپتھپائیں۔
6. ہر کنویں میں 100 μl TMB حل شامل کریں اور 20 منٹ کے لئے 20 - 25 ° C پر اندھیرے میں پلیٹ کو انکیوبیٹ کریں۔
7. رد عمل کو روکنے کے لئے ہر کنویں میں 50 μl اسٹاپ حل شامل کریں۔
8. مائکروپلیٹ ریڈر میں جاذب کو 10 منٹ کے اندر 450 ینیم پر پڑھیں (630nm کے طور پر 630nm
اعلی صحت سے متعلق کارکردگی کے لئے تجویز کردہ)۔