Комплект для виявлення антитіл SARS-COV-2 (ELISA)
【Принцип】
Набір для виявлення антитіл SARS-COV-2 заснований на конкурентній методології ІФА.
Використання очищеного домену зв'язування рецепторів (RBD), білок з білка вірусного шипа (S) та клітини -господаря
Рецептор ACE2, цей тест призначений для імітації нейтралізуючої взаємодії вірус-хостом.
Калібратори, контроль якості, зразки сироватки або плазми індивідуально добре змішані при розведенні
буфер, що містить кон'югат HACE2-HRP, аликвотується в невеликих трубах. Потім суміші переносять
Мікроплантовані свердловини, що містять іммобілізований рекомбінантний фрагмент RBD RBD (RBD) для
інкубація. Під час 30-хвилинної інкубації антитіло до RBD в калібраторах, QC та
Зразки будуть конкурувати з HACE2-HRP для специфічного зв'язування RBD, іммобілізованого в свердловинах. Після
Інкубація, свердловини промиваються 4 рази, щоб видалити незв'язаний кон'югат HACE2-HRP. Рішення
Потім TMB додають і інкубують протягом 20 хвилин при кімнатній температурі, що призводить до розробки
синій колір. Розробка кольору зупиняється з додаванням 1n HCl, а поглинання -
вимірюється спектрофотометрично при 450 нм. Інтенсивність утвореного кольору пропорційна
Кількість ферменту присутній і обернено пов'язаний із кількістю стандартів, аналізованих однаково.
Порівняння з кривою калібрування, утвореною наданими калібраторами, концентрація
Потім обчислюють нейтралізуючі антитіла в невідомому зразку.
【Необхідні матеріали, але не надані】
1. Дистильована або деіонізована вода
2. Точні піпетки: 10 мкл, 100 мкл, 200 мкл та 1 мл
3. Поради з одноразовими піпетками
4. Зчитувач мікропланшетів, здатний зчитувати поглинання при 450 нм.
5. Поглинання паперу
6. Графічний папір
7. Вихровий змішувач або еквівалент
【Колекція та зберігання зразків】
1. Зразки сироватки та плазми, зібрані в трубах, що містять K2-EDTA, можна використовувати для цього набору.
2. Зразки повинні бути обмежені і можуть зберігатися до 48 годин при 2 ° С - 8 ° С до аналізу.
Зразки, що проводяться довше (до 6 місяців) повинні бути заморожені лише один раз на -20 ° C до аналізу.
Уникайте повторних циклів заморожування-відтавання.
Протокол
【Підготовка реагенту】
1. Усі реагенти повинні бути виведені з холодильника і дозволяють повернутися до кімнатної температури перед використанням
(Від 20 ° до 25 ° C). Збережіть усі реагенти в холодильнику негайно після використання.
2. Усі зразки та елементи керування повинні бути вирвані перед використанням.
3. Підготовка розчину HACE2-HRP: Розбавте концентрат HACE2-HRP при коефіцієнті розведення 1: 51 з розведенням
Буфер. Наприклад, розведіть 100 мкл концентрату HACE2-HRP з 5,0 мл буфера розведення HRP до
Зробіть розчин HACE2-HRP.
4. 1 × розчин для промивання: розбавити розчин промивання 20 × деіонізованою або дистильованою водою
Коефіцієнт об'єму 1:19. Наприклад, розведіть 20 мл розчину 20 × промивання 380 мл деіонізованого або
Дистильована вода для виготовлення 400 мл розчину 1 × промивання.
【Процедура тестування】
1. В окремих трубах аликвота 120 мкл підготовленого розчину HACE2-HRP.
2. Додайте 6 мкл калібраторів, невідомі зразки, контроль якості в кожній трубці і добре перемішайте.
3. Перекладіть 100 мкл кожної суміші, приготованої на етапі 2, у відповідні мікропланшетні свердловини відповідно до
для заздалегідь заданої конфігурації тесту.
3. Накрийте тарілку пластиною ущільнювач і інкубуйте при 37 ° С протягом 30 хвилин.
4. Зніміть ущільнювач тарілки і промийте тарілку приблизно 300 мкл розчину 1 × промивання за чотири рази.
5. Торкніться тарілки на паперовому рушнику, щоб зняти залишкову рідину в лунках після промивання.
6. Додайте до кожної лунки 100 мкл розчину TMB і інкубуйте тарілку в темряві при 20 - 25 ° С протягом 20 хвилин.
7. Додайте до кожної лунки 50 мкл стоп -розчину, щоб зупинити реакцію.
8. Прочитайте поглинання в зчитувачі мікропланшетів при 450 нм протягом 10 хвилин (630 нм, як аксесуар
рекомендується для більш високої точної продуктивності).