Набір для виявлення нейтралізуючих антитіл SARS-CoV-2 (ELISA)
【ПРИНЦИП】
Набір для виявлення нейтралізуючих антитіл SARS-CoV-2 заснований на конкурентоспроможній методології ELISA.
Використовуючи очищений домен зв’язування рецептора (RBD), білок з білка вірусного шипа (S) і клітини-господаря
рецептора ACE2, цей тест призначений для імітації нейтралізуючої взаємодії вірус-господар.
Калібратори, засоби контролю якості та зразки сироватки або плазми окремо добре змішуються в розведенні
буфер, що містить кон’югат hACE2-HRP, аліквотований у невеликих пробірках. Потім суміші перекладаються
лунки мікропланшета, що містять іммобілізований рекомбінантний SARS-CoV-2 фрагмент RBD (RBD) для
інкубація. Під час 30-хвилинної інкубації RBD специфічне антитіло в калібраторах, КЯ та
зразки будуть конкурувати з hACE2-HRP за специфічне зв’язування RBD, іммобілізованого в лунках. Після
Після інкубації лунки промивають 4 рази для видалення незв’язаного кон’югату hACE2-HRP. Розчин
Потім додають TMB та інкубують протягом 20 хвилин при кімнатній температурі, що призводить до розвитку a
синій колір. Розвиток забарвлення припиняється додаванням 1 н. HCl, а поглинання зникає
виміряно спектрофотометрично при 450 нм. Інтенсивність утвореного кольору пропорційна
кількість присутнього ферменту та обернено пропорційна кількості стандартів, аналізованих таким же чином.
Через порівняння з калібрувальною кривою, сформованою наданими калібраторами, концентрація
потім обчислюють нейтралізуючі антитіла в невідомому зразку.
【МАТЕРІАЛИ НЕОБХІДНІ, АЛЕ НЕ НАДАЮТЬСЯ】
1. Дистильована або деіонізована вода
2. Точні піпетки: 10 мкл, 100 мкл, 200 мкл і 1 мл
3. Одноразові наконечники для піпеток
4. Зчитувач мікропланшетів, здатний зчитувати абсорбцію при 450 нм.
5. Вбираючий папір
6. Міліметровий папір
7. Вихровий змішувач або еквівалент
【ЗБІР І ЗБЕРІГАННЯ ЗРАЗКІВ】
1. Для цього набору можна використовувати зразки сироватки та плазми, зібрані в пробірки, що містять K2-EDTA.
2. Зразки повинні бути закриті кришкою та зберігатися протягом 48 годин при температурі 2 °C - 8 °C перед аналізом.
Зразки, які зберігаються протягом тривалого часу (до 6 місяців), слід заморозити лише один раз при -20 °C перед аналізом.
Уникайте повторних циклів заморожування-розморожування.
ПРОТОКОЛ
【Приготування реагентів】
1. Усі реагенти необхідно вийняти з холодильника та дати їм повернутися до кімнатної температури перед використанням
(від 20° до 25°C). Зберігайте всі реагенти в холодильнику одразу після використання.
2. Усі зразки та контролі слід перемішати перед використанням.
3. Приготування розчину hACE2-HRP: розведіть концентрат hACE2-HRP у співвідношенні розведення 1:51 за допомогою Dilution
Буфер. Наприклад, розведіть 100 мкл концентрату hACE2-HRP 5,0 мл буфера для розведення HRP, щоб
зробити розчин hACE2-HRP.
4. Приготування 1× промивного розчину: розведіть 20× промивний розчин деіонізованою або дистильованою водою за допомогою
об'ємне співвідношення 1:19. Наприклад, розведіть 20 мл розчину для промивання 20 × 380 мл деіонізованого або
дистильованої води, щоб отримати 400 мл 1× промивного розчину.
【Процедура тестування】
1. В окремі пробірки розмістіть 120 мкл готового розчину hACE2-HRP.
2. Додайте 6 мкл калібраторів, невідомих зразків, контролю якості в кожну пробірку та добре перемішайте.
3. Перенесіть 100 мкл кожної суміші, приготовленої на кроці 2, у відповідні лунки мікропланшета відповідно до
до попередньо розробленої тестової конфігурації.
3. Накрийте планшет Plate Sealer та інкубуйте при 37°C протягом 30 хвилин.
4. Зніміть ущільнювач планшета та промийте планшет приблизно 300 мкл 1× промивного розчину на лунку чотири рази.
5. Постукайте планшетом по паперовому рушнику, щоб видалити залишки рідини в лунках після етапів промивання.
6. Додайте 100 мкл розчину ТМВ до кожної лунки та інкубуйте планшет у темряві при 20–25°C протягом 20 хвилин.
7. Додайте 50 мкл стоп-розчину в кожну лунку, щоб зупинити реакцію.
8. Прочитайте поглинання в рідері мікропланшетів при 450 нм протягом 10 хвилин (630 нм як аксесуар
рекомендовано для більшої точності).