SARS-CoV-2 Антителонны ачыклау комплекты (ELISA)
【Принцип】
SARS-CoV-2 Антителонны нейтральләштерүче комплект ELISA методикасына нигезләнгән.
Чистартылган рецептор бәйләүче домен (РБД), вируслы ботак (S) протеины һәм кабул итүче күзәнәк куллану
ACE2 рецепторы, бу тест вирус хуҗасы нейтральләштерүче үзара бәйләнешне охшату өчен эшләнгән.
Калибрлаучылар, Сыйфат Контрольләре, һәм сарум яки плазма үрнәкләре эретелгәндә аерым катнашалар
кечкенә трубаларда аликотланган HACE2-HRP конжугаты булган буфер.Аннары катнашмалар күчерелә
иммобилизацияләнгән рекомбинант SARS-CoV-2 RBD фрагменты (РБД) булган микроплит скважиналар өчен
инкубация.30 минутлык инкубация вакытында, калибраторларда RBD махсус антитела, QC һәм
үрнәкләр коеларда имобилизацияләнгән РБДны бәйләү өчен hACE2-HRP белән көч сынашачак.Соңыннан
инкубация, скважиналар HACE2-HRP конжугатын чыгару өчен 4 тапкыр юыла.Чишелеш
Аннары ТМБ өстәлә һәм бүлмә температурасында 20 минут инкубацияләнә, нәтиҗәдә a үсешенә китерә
зәңгәр төс.Төсләр үсеше 1N HCl кушылу белән туктатыла, һәм үзләштерү
спектропотометрик рәвештә 450 нм.Формалашкан төснең интенсивлыгы пропорциональ
булган фермент күләме, һәм шул ук ысул белән ясалган стандартлар күләме белән капма-каршы бәйле.
Бирелгән калибраторлар формалашкан калибрлау сызыгы белән чагыштыру аша, концентрация
билгесез үрнәктә антителаларны нейтральләштерү аннары исәпләнә.
【МАТЕРИАЛЛАР ТАЛӘП БУЛЫР, ләкин тәкъдим ителмәгән】
1. Дистилляцияләнгән яки деонизацияләнгән су
2. Төгәл торбалар: 10μL, 100μL, 200μL һәм 1 мл
3. Бер тапкыр кулланыла торган пипетка киңәшләре
4. Микроплит укучы 450нмда үзләштерүне укый ала.
5. Абсорбент кәгазь
6. График кәгазь
7. Вортекс миксеры яки эквивалент
【ECзенчәлекле җыю һәм саклау】
1. Бу комплект өчен K2-EDTA булган трубаларда тупланган серум һәм плазма үрнәкләре кулланылырга мөмкин.
2. Specрнәкләр капланырга тиеш һәм анализ ясаганчы 2 ° C - 8 ° C кадәр 48 сәгатькә кадәр сакланырга мөмкин.
Озаграк тотылган үрнәкләр (6 айга кадәр) анализ алдыннан -20 ° C температурада бер тапкыр туңдырылырга тиеш.
Кабат туңдыру циклыннан сакланыгыз.
Протокол
【Реагент әзерләү】
1. Барлык реагентлар суыткычтан чыгарылырга һәм куллану алдыннан бүлмә температурасына кире кайтырга рөхсәт ителергә тиеш
(20 ° 25 ° C).Барлык реагентларны суыткычта саклагыз.
2. Барлык үрнәкләр һәм контрольләр кулланылганчы вортекс булырга тиеш.
3. HACE2-HRP чишелешен әзерләү: HACE2-HRP концентратын эретү белән 1: 51 эретү коэффициентында.
Буфер.Мисал өчен, 100 μL HACE2-HRP концентратын 5.0мл HRP эретү буферы белән эретегез.
hACE2-HRP чишелешен ясарга.
4. 1 × Чишелешне юу әзерләү: 20 × Чишелешне деонизацияләнгән яки дистилляцияләнгән су белән эретегез.
күләм күләме 1:19.Мәсәлән, 20 мл 20 × юу чишелешен 380 мл деонизацияләнгән яки
400 мл 1 × юу чишелеше өчен дистилляцияләнгән су.
【Тест процедурасы】
1. Аерым торбаларда, 120μL аликот әзерләнгән hACE2-HRP чишелеше.
2. tubeәр трубага 6 μЛ калибратор, билгесез үрнәкләр, сыйфат контроле кушыгыз һәм яхшылап кушыгыз.
3. 2 адымда әзерләнгән һәр катнашманың 100μЛ тиешле микроплит скважиналарына күчерегез
алдан эшләнгән тест конфигурациясе.
3. Тәлинкәне плитка мөһере белән каплагыз һәм 37 минутта 30 минут инкубацияләгез.
4. Тәлинкә плиткасын алыгыз һәм тәлинкәгә якынча 300 μL 1 × Чишелешне дүрт тапкыр юыгыз.
5. Адымнарны юганнан соң коедагы сыеклыкны чыгару өчен кәгазь сөлгегә тәлинкәгә басыгыз.
6. wellәр скважинага 100 μL TMB чишелешен кушыгыз һәм тәлинкәне 20-25 ° C караңгыда 20 минутка инкубацияләгез.
7. Реакцияне туктатыр өчен, һәр коега 50 μL Stop Solution кушыгыз.
8. Микроплит укучыдагы сеңдерүне 10 минут эчендә 450 нм (аксессуар кебек 630нм) укыгыз
югары төгәллек күрсәтү өчен тәкъдим ителә).
