SARS-CoV-2 Nötrleştirici Antikor Tespit Kiti (ELISA)
【PRENSİP]
SARS-CoV-2 Nötrleştirici Antikor Tespit Kiti, rekabetçi ELISA metodolojisine dayanmaktadır.
Saflaştırılmış reseptör bağlanma alanı (RBD), viral spike (S) proteininden ve konakçı hücreden gelen protein kullanılarak
ACE2 reseptörü olan bu test, virüs-konakçı nötrleştirici etkileşimini taklit etmek için tasarlanmıştır.
Kalibratörler, Kalite Kontroller ve serum veya plazma örnekleri seyreltmede ayrı ayrı iyice karıştırılır
küçük tüplere bölünmüş hACE2-HRP konjugatını içeren tampon. Daha sonra karışımlar aktarılır.
hareketsizleştirilmiş rekombinant SARS-CoV-2 RBD fragmanını (RBD) içeren mikroplaka kuyuları
kuluçka. 30 dakikalık inkübasyon sırasında kalibratörlerdeki, QC ve QC'deki RBD'ye özgü antikor
numuneler, oyuklarda hareketsizleştirilmiş RBD'ye spesifik bağlanma için hACE2-HRP ile rekabet edecektir. Sonrasında
İnkübasyonun ardından, bağlanmamış hACE2-HRP konjugatını çıkarmak için kuyucuklar 4 kez yıkanır. Bir çözüm
Daha sonra TMB eklenir ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir, bu da bir
mavi renk. 1N HCl ilavesi ile renk gelişimi durdurulur ve absorbans arttırılır.
450 nm'de spektrofotometrik olarak ölçüldü. Oluşan rengin yoğunluğu renkle orantılıdır.
mevcut enzim miktarı ile aynı şekilde test edilen standartların miktarı ile ters ilişkilidir.
Sağlanan kalibratörler tarafından oluşturulan kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırma yoluyla, konsantrasyonu
Daha sonra bilinmeyen numunedeki nötralize edici antikorlar hesaplanır.
【GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAYAN MALZEMELER]
1. Damıtılmış veya deiyonize su
2. Hassas pipetler: 10μL, 100μL,200μL ve 1 mL
3. Tek kullanımlık pipet uçları
4. 450nm'de absorbansı okuyabilen mikroplaka okuyucu.
5. Emici kağıt
6. Grafik kağıdı
7. Vorteks karıştırıcı veya eşdeğeri
【ÖRNEK TOPLAMA VE SAKLAMA]
1. K2-EDTA içeren tüplerde toplanan Serum ve Plazma numuneleri bu kit için kullanılabilir.
2. Örnekler kapatılmalı ve testten önce 2 °C - 8 °C'de 48 saate kadar saklanmalıdır.
Daha uzun süre (6 aya kadar) tutulan numuneler, testten önce -20 °C'de yalnızca bir kez dondurulmalıdır.
Tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçının.
PROTOKOL
【Reaktif Hazırlama]
1. Kullanmadan önce tüm reaktifler buzdolabından çıkarılmalı ve oda sıcaklığına dönmesine izin verilmelidir.
(20° ila 25°C). Tüm reaktifleri kullanımdan hemen sonra buzdolabında saklayın.
2. Tüm numuneler ve kontroller kullanımdan önce vortekslenmelidir.
3. hACE2-HRP Solüsyonunun Hazırlanması: hACE2-HRP konsantresini Seyreltme ile 1:51 seyreltme oranında seyreltin.
Tampon. Örneğin, 100 μL hACE2-HRP konsantresini 5,0 mL HRP Seyreltme Tamponu ile seyreltin.
hACE2-HRP çözümü hazırlayın.
4. 1× Yıkama Solüsyonunun Hazırlanması: 20× Yıkama Solüsyonunu deiyonize veya damıtılmış suyla seyreltin.
1:19 hacim oranı. Örneğin, 20 mL 20x Yıkama Solüsyonunu 380 mL deiyonize veya
400 mL 1x Yıkama Çözeltisi hazırlamak için damıtılmış su.
【Test Prosedürü]
1. Ayrı tüplerde, hazırlanan hACE2-HRP Solüsyonunun 120μL'lik kısmını bölün.
2. Her tüpe 6 μL kalibratör, bilinmeyen örnekler ve kalite kontrolleri ekleyin ve iyice karıştırın.
3. Adım 2'de hazırlanan her karışımın 100μL'sini uygun mikroplaka kuyularına aktarın.
önceden tasarlanmış test konfigürasyonuna.
3. Plakayı Plaka Kapatıcı ile kapatın ve 30 dakika boyunca 37°C'de inkübe edin.
4. Plaka Kapatıcıyı çıkarın ve plakayı kuyucuk başına yaklaşık 300 μL 1x Yıkama Solüsyonu ile dört kez yıkayın.
5. Yıkama adımlarından sonra kuyucuklardaki kalan sıvıyı çıkarmak için plakayı kağıt havlu üzerine hafifçe vurun.
6. Her kuyucuğa 100 μL TMB Solüsyonu ekleyin ve plakayı karanlıkta 20 - 25°C'de 20 dakika inkübe edin.
7. Reaksiyonu durdurmak için her kuyucuğa 50 μL Durdurma Solüsyonu ekleyin.
8. Mikroplak okuyucudaki absorbansı 450 nm'de 10 dakika içinde okuyun (aksesuar olarak 630 nm
Daha yüksek hassasiyet performansı için önerilir).