SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit (ELISA)
【PRINSIPYO】
Ang SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit ay batay sa mapagkumpitensyang pamamaraan ng ELISA.
Gamit ang purified receptor binding domain (RBD), protina mula sa viral spike (S) na protina at ang host cell
receptor ACE2, ang pagsubok na ito ay idinisenyo upang gayahin ang pakikipag-ugnayan sa pagneutralize ng host ng virus.
Ang mga calibrator, Quality Control, at serum o plasma sample ay isa-isang pinaghalo nang maayos sa dilution
buffer na naglalaman ng hACE2-HRP conjugate na inilagay sa maliliit na tubo.Pagkatapos ang mga mixtures ay inilipat sa
ang mga balon ng microplate na naglalaman ng immobilized recombinant na SARS-CoV-2 RBD fragment (RBD) para sa
pagpapapisa ng itlog.Sa loob ng 30 minutong incubation, ang RBD specific antibody sa mga calibrator, QC at
ang mga sample ay makikipagkumpitensya sa hACE2-HRP para sa partikular na pagbubuklod ng RBD na hindi kumikilos sa mga balon.Pagkatapos
sa pagpapapisa ng itlog, ang mga balon ay hinuhugasan ng 4 na beses upang alisin ang hindi nakatali na hACE2-HRP conjugate.Isang solusyon ng
Ang TMB ay pagkatapos ay idinagdag at incubated sa loob ng 20 minuto sa temperatura ng silid, na nagreresulta sa pagbuo ng a
kulay asul.Ang pag-unlad ng kulay ay tumigil sa pagdaragdag ng 1N HCl, at ang pagsipsip ay
sinusukat spectrophotometrically sa 450 nm.Ang intensity ng kulay na nabuo ay proporsyonal sa
dami ng enzyme na naroroon, at inversely na nauugnay sa dami ng mga pamantayang sinusuri sa parehong paraan.
Sa pamamagitan ng paghahambing sa calibration curve na nabuo ng mga ibinigay na calibrators, ang konsentrasyon ng
pagkatapos ay kalkulahin ang neutralizing antibodies sa hindi kilalang sample.
【KAILANGAN NG MGA MATERYAL NGUNIT HINDI IBINIGAY】
1. Distilled o deionized na tubig
2. Precision pipette: 10μL, 100μL,200μL at 1 mL
3. Mga disposable pipette tip
4. Microplate reader na may kakayahang magbasa ng absorbance sa 450nm.
5. Absorbent na papel
6. Graph paper
7. Vortex mixer o katumbas nito
【PAGKOLEKSYON AT PAG-IMPORYA NG SPECIMEN】
1. Ang mga sample ng serum at Plasma na nakolekta sa mga tubo na naglalaman ng K2-EDTA ay maaaring gamitin para sa kit na ito.
2. Ang mga specimen ay dapat na may takip at maaaring maimbak nang hanggang 48 oras sa 2 °C - 8 °C bago ang assaying.
Ang mga specimen na hawak ng mas mahabang panahon (hanggang 6 na buwan) ay dapat na i-freeze nang isang beses lamang sa -20 °C bago ang assay.
Iwasan ang paulit-ulit na freeze-thaw cycle.
PROTOCOL
【Paghahanda ng Reagent】
1. Ang lahat ng mga reagents ay dapat alisin mula sa pagpapalamig at hayaang bumalik sa temperatura ng silid bago gamitin
(20° hanggang 25°C).I-save ang lahat ng reagents sa refrigerator kaagad pagkatapos gamitin.
2. Ang lahat ng mga sample at mga kontrol ay dapat na vortexed bago gamitin.
3. Paghahanda ng hACE2-HRP Solution: Dilute ang hACE2-HRP concentrate sa 1: 51 dilution ratio na may Dilution
Buffer.Halimbawa, palabnawin ang 100 μL ng hACE2-HRP concentrate na may 5.0mL ng HRP Dilution Buffer sa
gumawa ng hACE2-HRP na solusyon.
4. Paghahanda ng 1× Wash Solution: Dilute ang 20× Wash Solution na may deionized o distilled water na may
ratio ng volume na 1:19.Halimbawa, palabnawin ang 20 mL ng 20× Wash Solution na may 380 mL ng deionized o
distilled water para makagawa ng 400 mL ng 1× Wash Solution.
【Pamamaraan ng Pagsubok】
1. Sa magkahiwalay na mga tubo, aliquot 120μL ng inihandang hACE2-HRP Solution.
2. Magdagdag ng 6 μL ng mga calibrator, hindi kilalang mga sample, mga kontrol sa kalidad sa bawat tubo at haluing mabuti.
3. Ilipat ang 100μL ng bawat halo na inihanda sa hakbang 2 sa kaukulang mga balon ng microplate ayon sa
sa predesigned test configuration.
3. Takpan ang plato ng Plate Sealer at i-incubate sa 37°C sa loob ng 30 minuto.
4. Alisin ang Plate Sealer at hugasan ang plato na may humigit-kumulang 300 μL ng 1 × Wash Solution bawat balon nang apat na beses.
5. Tapikin ang plato sa tuwalya ng papel upang alisin ang natitirang likido sa mga balon pagkatapos ng mga hakbang sa paghuhugas.
6. Magdagdag ng 100 μL ng TMB Solution sa bawat balon at i-incubate ang plato sa madilim sa 20 - 25°C sa loob ng 20 minuto.
7. Magdagdag ng 50 μL ng Stop Solution sa bawat balon upang ihinto ang reaksyon.
8. Basahin ang absorbance sa microplate reader sa 450 nm sa loob ng 10 minuto (630nm bilang accessory ay
inirerekomenda para sa mas mataas na pagganap ng katumpakan).
