SARS-COV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit (ELISA)
【Prinsipyo】
Ang SARS-CoV-2 neutralizing antibody detection kit ay batay sa mapagkumpitensyang pamamaraan ng ELISA.
Gamit ang purified receptor binding domain (RBD), protina mula sa viral spike (s) protina at ang host cell
Receptor ACE2, ang pagsubok na ito ay idinisenyo upang gayahin ang pakikipag-ugnay sa virus-host neutralizing.
Ang mga calibrator, mga kontrol sa kalidad, at mga sample ng suwero o plasma ay isa -isa na halo -halong mabuti sa pagbabanto
Ang buffer na naglalaman ng HACE2-HRP conjugate na na-aliquoted sa maliit na tubo. Pagkatapos ang mga mixtures ay inilipat sa
Ang mga balon ng microplate na naglalaman ng immobilized recombinant SARS-COV-2 RBD fragment (RBD) para sa
pagpapapisa ng itlog. Sa panahon ng 30-minuto na pagpapapisa ng itlog, ang tiyak na antibody ng RBD sa mga calibrator, QC at
Ang mga sample ay makikipagkumpitensya sa HACE2-HRP para sa tiyak na pagbubuklod ng RBD na hindi na-immobilized sa mga balon. Pagkatapos
Ang pagpapapisa ng itlog, ang mga balon ay hugasan ng 4 na beses upang alisin ang walang batayang HACE2-HRP conjugate. Isang solusyon ng
Ang TMB ay pagkatapos ay idinagdag at natupok ng 20 minuto sa temperatura ng silid, na nagreresulta sa pagbuo ng a
asul na kulay. Ang pag -unlad ng kulay ay tumigil sa pagdaragdag ng 1N HCl, at ang pagsipsip ay
Sinusukat na spectrophotometrically sa 450 nm. Ang intensity ng kulay na nabuo ay proporsyonal sa
halaga ng enzyme na naroroon, at baligtad na nauugnay sa dami ng mga pamantayan na nasaksihan sa parehong paraan.
Sa pamamagitan ng paghahambing sa calibration curve na nabuo ng ibinigay na mga calibrator, ang konsentrasyon ng
Ang pag -neutralize ng mga antibodies sa hindi kilalang sample ay pagkatapos ay kinakalkula.
【Kinakailangan ang mga materyales ngunit hindi ibinigay】
1. Distilled o Deionized Water
2. Mga pipette ng katumpakan: 10μl, 100μl, 200μl at 1 ml
3. Mga Tip sa Pipette ng Pagtatapon
4. Microplate reader na may kakayahang magbasa ng pagsipsip sa 450nm.
5. Sumisipsip na papel
6. Graph Paper
7. Vortex Mixer o katumbas
【Ang koleksyon ng ispesimen at imbakan】
1. Ang mga sample ng serum at plasma na nakolekta sa mga tubo na naglalaman ng K2-EDTA ay maaaring magamit para sa kit na ito.
2. Ang mga specimen ay dapat na naka -cap at maaaring maiimbak ng hanggang sa 48 oras sa 2 ° C - 8 ° C bago ang pag -assaying.
Ang mga ispesimen na gaganapin para sa mas mahabang oras (hanggang sa 6 na buwan) ay dapat na nagyelo nang isang beses lamang sa -20 ° C bago ang assay.
Iwasan ang paulit-ulit na mga siklo ng freeze-thaw.
Protocol
【Reagent paghahanda】
1. Ang lahat ng mga reagents ay dapat makuha mula sa pagpapalamig at pinapayagan na bumalik sa temperatura ng silid bago gamitin
(20 ° hanggang 25 ° C). I -save ang lahat ng mga reagents sa ref kaagad pagkatapos gamitin.
2. Lahat ng mga sample at kontrol ay dapat na vortexed bago gamitin.
3. HACE2-HRP Solution Paghahanda: Dilute HACE2-HRP Pag-concentrate sa 1: 51 Ratio ng pagbabanto na may pagbabanto
Buffer. Halimbawa, dilute ang 100 μl ng hace2-hrp concentrate na may 5.0ml ng HRP dilution buffer sa
Gumawa ng isang solusyon ng HACE2-HRP.
4.
Dami ng Ratio ng 1:19. Halimbawa, dilute 20 ml ng 20 × hugasan na solusyon na may 380 ml ng deionized o
distilled water upang makagawa ng 400 ml ng 1 × hugasan na solusyon.
【Pamamaraan sa Pagsubok】
1. Sa magkahiwalay na mga tubo, aliquot 120μl ng handa na solusyon ng HACE2-HRP.
2. Magdagdag ng 6 μl ng mga calibrator, hindi kilalang mga sample, mga kontrol sa kalidad sa bawat tubo at ihalo nang maayos.
3. Ilipat ang 100μl ng bawat halo na inihanda sa hakbang 2 sa kaukulang mga balon ng microplate ayon
upang matukoy ang pagsasaayos ng pagsubok.
3. Takpan ang plato na may plate sealer at mag -incubate sa 37 ° C sa loob ng 30 minuto.
4. Alisin ang plate sealer at hugasan ang plate na may humigit -kumulang na 300 μl ng 1 × hugasan na solusyon sa bawat maayos na apat na beses.
5. Tapikin ang plato sa tuwalya ng papel upang alisin ang natitirang likido sa mga balon pagkatapos ng mga hakbang sa paghuhugas.
6. Magdagdag ng 100 μl ng solusyon ng TMB sa bawat balon at mapupuksa ang plato sa madilim sa 20 - 25 ° C sa loob ng 20 minuto.
7. Magdagdag ng 50 μl ng paghinto ng solusyon sa bawat balon upang ihinto ang reaksyon.
8 Basahin ang pagsipsip sa microplate reader sa 450 nm sa loob ng 10 minuto (630nm bilang accessory ay
inirerekumenda para sa mas mataas na pagganap ng katumpakan).