ชุดตรวจหาแอนติบอดีที่เป็นกลางสำหรับ SARS-CoV-2 (ELISA)
-หลักการ-
ชุดตรวจหาแอนติบอดีที่เป็นกลางของ SARS-CoV-2 ใช้วิธีการทดสอบ ELISA ที่แข่งขันได้
การใช้โดเมนการจับรีเซพเตอร์บริสุทธิ์ (RBD) โปรตีนจากโปรตีนสไปค์ของไวรัส (S) และเซลล์เจ้าบ้าน
ตัวรับ ACE2 การทดสอบนี้ออกแบบมาเพื่อเลียนแบบปฏิสัมพันธ์ที่ทำให้ไวรัสและโฮสต์เป็นกลาง
เครื่องสอบเทียบ การควบคุมคุณภาพ และตัวอย่างซีรัมหรือพลาสมาจะถูกผสมให้เข้ากันในการเจือจาง
บัฟเฟอร์ที่มีคอนจูเกต hACE2-HRP แบ่งส่วนในหลอดขนาดเล็กจากนั้นส่วนผสมจะถูกถ่ายโอนเข้าไป
หลุมไมโครเพลทที่มีชิ้นส่วน RBD ของ SARS-CoV-2 RBD (RBD) ชนิดรีคอมบิแนนท์ที่ตรึงไว้สำหรับ
การฟักตัวในระหว่างการฟักตัว 30 นาที แอนติบอดีจำเพาะ RBD ในเครื่องสอบเทียบ, QC และ
ตัวอย่างจะแข่งขันกับ hACE2-HRP สำหรับการจับเฉพาะ RBD ที่ถูกตรึงไว้ในหลุมหลังจาก
ในการฟักไข่ บ่อจะถูกล้าง 4 ครั้งเพื่อกำจัดคอนจูเกต hACE2-HRP ที่ไม่ถูกผูกออกทางออกของ
จากนั้นเติม TMB และบ่มเป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ส่งผลให้เกิดการพัฒนาของ
สีฟ้า.การพัฒนาสีหยุดลงด้วยการเติม 1N HCl และการดูดกลืนแสงคือ
วัดด้วยสเปกโตรโฟโตเมตริกที่ 450 นาโนเมตรความเข้มของสีที่เกิดขึ้นนั้นแปรผันตาม
ปริมาณของเอนไซม์ที่มีอยู่ และมีความสัมพันธ์ผกผันกับปริมาณของมาตรฐานที่ประเมินในลักษณะเดียวกัน
เมื่อเปรียบเทียบกับเส้นโค้งการสอบเทียบที่เกิดจากเครื่องสอบเทียบที่ให้มา ความเข้มข้นของ
จากนั้นคำนวณแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางในตัวอย่างที่ไม่รู้จัก
-วัสดุที่จำเป็นแต่ไม่ได้จัดเตรียมไว้ให้-
1. น้ำกลั่นหรือปราศจากไอออน
2. ปิเปตที่มีความแม่นยำ: 10μL, 100μL, 200μL และ 1 มล.
3. ทิปปิเปตแบบใช้แล้วทิ้ง
4. เครื่องอ่านไมโครเพลทที่สามารถอ่านค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร
5. กระดาษดูดซับ
6. กระดาษกราฟ
7. เครื่องผสม Vortex หรือเทียบเท่า
-การเก็บตัวอย่างและการเก็บรักษา-
1. ตัวอย่างเซรั่มและพลาสมาที่เก็บในหลอดที่มี K2-EDTA สามารถใช้กับชุดอุปกรณ์นี้ได้
2. ตัวอย่างควรปิดฝาและอาจเก็บไว้ได้นานถึง 48 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 2 °C - 8 °C ก่อนทำการวิเคราะห์
ตัวอย่างที่เก็บไว้เป็นเวลานาน (สูงสุด 6 เดือน) ควรแช่แข็งเพียงครั้งเดียวที่อุณหภูมิ -20 °C ก่อนการทดสอบ
หลีกเลี่ยงการแช่แข็ง-ละลายซ้ำๆ
มาตรการ
-การเตรียมรีเอเจนต์-
1. รีเอเจนต์ทั้งหมดต้องถูกนำออกจากตู้เย็นและปล่อยให้กลับสู่อุณหภูมิห้องก่อนใช้งาน
(20° ถึง 25°C)เก็บรีเอเจนต์ทั้งหมดไว้ในตู้เย็นทันทีหลังการใช้งาน
2. ตัวอย่างและส่วนควบคุมทั้งหมดควรหมุนวนก่อนใช้งาน
3. การเตรียมสารละลาย hACE2-HRP: เจือจางความเข้มข้นของ hACE2-HRP ที่อัตราส่วนการเจือจาง 1: 51 ด้วยการเจือจาง
กันชน.ตัวอย่างเช่น เจือจาง hACE2-HRP เข้มข้น 100 μL กับบัฟเฟอร์เจือจาง HRP 5.0 มล.
สร้างสารละลาย hACE2-HRP
4. การเตรียมน้ำยาล้าง 1×: เจือจางน้ำยาล้าง 20× ด้วยน้ำปราศจากไอออนหรือน้ำกลั่นด้วย
อัตราส่วนปริมาตร 1:19.ตัวอย่างเช่น เจือจางสารละลายล้าง 20× 20 มล. กับน้ำยาขจัดไอออน 380 มล. หรือ
น้ำกลั่นเพื่อทำน้ำยาล้าง 1× 400 มล.
-กระบวนการทดสอบ-
1. ในหลอดที่แยกจากกัน ให้แบ่งสารละลาย hACE2-HRP ที่เตรียมไว้ไว้ 120μL
2. เติมเครื่องสอบเทียบ 6 ไมโครลิตร ตัวอย่างที่ไม่รู้จัก การควบคุมคุณภาพในแต่ละหลอด และผสมให้เข้ากัน
3. ถ่าย 100μL ของส่วนผสมแต่ละรายการที่เตรียมในขั้นตอนที่ 2 ลงในหลุมไมโครเพลทที่เกี่ยวข้อง
เพื่อกำหนดค่าการทดสอบที่ออกแบบไว้ล่วงหน้า
3. ปิดจานด้วย Plate Sealer และฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 30 นาที
4. ถอดเพลทซีลเลอร์ออกแล้วล้างเพลทด้วยน้ำยาล้าง 1× ประมาณ 300 ไมโครลิตร ต่อหลุม 4 ครั้ง
5. แตะจานบนผ้ากระดาษเพื่อขจัดของเหลวที่ตกค้างในบ่อหลังจากขั้นตอนการล้าง
6. เติม TMB Solution 100 μL ลงในแต่ละหลุม และบ่มจานในที่มืดที่อุณหภูมิ 20 - 25°C เป็นเวลา 20 นาที
7. เติม Stop Solution 50 ไมโครลิตรในแต่ละหลุมเพื่อหยุดปฏิกิริยา
8. อ่านค่าการดูดกลืนแสงในตัวอ่านไมโครเพลทที่ 450 นาโนเมตรภายใน 10 นาที (630 นาโนเมตรเป็นอุปกรณ์เสริม
แนะนำเพื่อประสิทธิภาพที่แม่นยำยิ่งขึ้น)
