Маҷмӯаи муайянкунии антителоҳои безараргардонандаи SARS-CoV-2 (ELISA)
【ПРИНЦИП】
Маҷмӯаи муайянкунии антителоҳои безараргардонии SARS-CoV-2 ба методологияи рақобатпазири ELISA асос ёфтааст.
Истифодаи домени ҳатмии ретсепторҳои тозашуда (RBD), протеин аз протеини хӯшаи вирусӣ (S) ва ҳуҷайраи мизбон
ретсептори ACE2, ин озмоиш барои тақлид кардани таъсири мутақобилаи безараргардонии вирус ва мизбон тарҳрезӣ шудааст.
Калибраторҳо, назорати сифат ва намунаҳои хуноба ё плазма ба таври инфиродӣ дар маҳлул хуб омехта карда мешаванд
буфери дорои конъюгати hACE2-HRP дар қубурҳои хурд.Сипас омехтаҳо ба он интиқол дода мешаванд
чоҳҳои микропластикӣ, ки дорои порчаи рекомбинати иммобилизатсияшудаи SARS-CoV-2 RBD (RBD) барои
инкубатсия.Дар давоми инкубатсияи 30-дақиқа, антитело мушаххаси RBD дар калибраторҳо, QC ва
намунаҳо бо hACE2-HRP барои пайваст кардани мушаххаси RBD дар чоҳҳо рақобат мекунанд.Баъди
инкубатсия, чоҳҳо 4 маротиба шуста мешаванд, то конъюгати пайвастнашудаи hACE2-HRP хориҷ карда шаванд.Як ҳалли
Сипас TMB илова карда мешавад ва дар давоми 20 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда мешавад, ки дар натиҷа а
ранги кабуд.Рушди ранг бо иловаи 1N HCl қатъ карда мешавад ва ҷаббида мешавад
спектрофотометрӣ дар 450 нм чен карда мешавад.Шиддати ранги ташаккулёфта ба он мутаносиб аст
Миқдори фермент мавҷуд аст ва ба миқдори стандартҳои ба ҳамин тарз таҳлилшуда баръакс алоқаманд аст.
Тавассути мукоиса бо хатти калибрченкунӣ, ки аз ҷониби калибраторҳои пешниҳодшуда ташаккул ёфтааст, консентратсияи
пас антителоҳои безараркунанда дар намунаи номаълум ҳисоб карда мешаванд.
【МАТЕРИАЛҲОИ ДАРКОР, ВАЛЕ ТАЪМИН НАШУДААНД】
1. Оби тозашуда ё деионизатсияшуда
2. Пипеткаҳои дақиқ: 10μL, 100μL, 200μL ва 1 мл
3. Маслиҳатҳои пипеткаҳои якдафъаина
4. Хонандаи microplate қодир ба хондани абсорбент дар 450nm.
5. Когази абсорбент
6. Варақаи графикӣ
7. Миксери гирдоби ё муодили он
【ЧАМЪОВАРЙ ВА НИГАХДОРИИ НАМУНАХО】
1. Намунаҳои хуноба ва плазмаеро, ки дар қубурҳои дорои K2-EDTA ҷамъ оварда шудаанд, барои ин маҷмӯа истифода бурдан мумкин аст.
2. Намунаҳо бояд пӯшонида шаванд ва онҳоро то 48 соат дар ҳарорати 2 °C - 8 °C пеш аз санҷиш нигоҳ доштан мумкин аст.
Намунаҳое, ки барои муддати тӯлонӣ нигоҳ дошта мешаванд (то 6 моҳ) бояд танҳо як маротиба дар -20 °C пеш аз ташхис ях карда шаванд.
Аз давраҳои такрории яхкунӣ худдорӣ намоед.
ПРОТОКОЛ
【Тайёр кардани реактив】
1. Ҳама реактивҳо бояд аз яхдон гирифта шаванд ва пеш аз истифода ба ҳарорати хонагӣ баргарданд
(20° то 25°С).Ҳама реактивҳоро фавран пас аз истифода дар яхдон захира кунед.
2. Ҳамаи намунаҳо ва назорат бояд пеш аз истифода vortexed.
3. Омода кардани маҳлули hACE2-HRP: Консентрати hACE2-HRP-ро дар таносуби 1:51 маҳлул бо маҳлул омехта кунед
Буфер.Масалан, 100 мкл консентрати hACE2-HRP-ро бо 5,0 мл буфери ҳалкунии HRP ҳал кунед.
маҳлули hACE2-HRP тайёр кунед.
4. Омода кардани маҳлули шустани 1 ×: Маҳлули шустани 20 ×-ро бо оби деионизатсияшуда ё дистиллшуда бо оби тозашуда ҳал кунед.
таносуби ҳаҷми 1:19.Масалан, 20 мл маҳлули шустани 20 × бо 380 мл деионизатсияшуда ё
оби софшуда барои тайёр кардани 400 мл 1 × Маҳлули шустан.
【Тартиби санҷиш】
1. Дар қубурҳои алоҳида, аликвот 120 мкл аз маҳлули тайёршудаи hACE2-HRP.
2. Ба ҳар як қубур 6 мкл калибраторҳо, намунаҳои номаълум, назорати сифат илова кунед ва хуб омехта кунед.
3. 100 мкЛ ҳар як омехтаи дар қадами 2 омодашударо ба чоҳҳои мувофиқи микропластикҳо интиқол диҳед.
ба конфигуратсияи санҷиши пешакӣ таҳияшуда.
3. Табақро бо плиткаи пломба пӯшонед ва дар ҳарорати 37°C барои 30 дақиқа инкубатсия кунед.
4. Плитаи мӯҳркунандаро хориҷ кунед ва табақро бо тақрибан 300 мкл Маҳлули шустани 1× барои ҳар як чоҳ чор маротиба бишӯед.
5. Табақро ба рӯймолчаи коғазӣ ламс кунед, то моеъи боқимондаро дар чоҳҳо пас аз шустан тоза кунед.
6. Ба ҳар як чоҳ 100 мкл Маҳлули TMB илова кунед ва табақро дар торикӣ дар ҳарорати 20 - 25°C барои 20 дақиқа инкубатсия кунед.
7. Барои боздоштани реаксия ба ҳар як чоҳ 50 мкл Маҳлули Stop илова кунед.
8. Дар давоми 10 дақиқа абсорбенсро дар хонандаи микроплата дар 450 нм хонед (630 нм ҳамчун лавозимот
барои иҷрои дақиқи баландтар тавсия дода мешавад).
