SARS-CoV-2 న్యూట్రలైజింగ్ యాంటీబాడీ డిటెక్షన్ కిట్ (ELISA)
【సూత్రం】
SARS-CoV-2 న్యూట్రలైజింగ్ యాంటీబాడీ డిటెక్షన్ కిట్ పోటీ ELISA మెథడాలజీపై ఆధారపడి ఉంటుంది.
ప్యూరిఫైడ్ రిసెప్టర్ బైండింగ్ డొమైన్ (RBD), వైరల్ స్పైక్ (S) ప్రోటీన్ మరియు హోస్ట్ సెల్ నుండి ప్రోటీన్‌ని ఉపయోగించడం
గ్రాహక ACE2, ఈ పరీక్ష వైరస్-హోస్ట్ న్యూట్రలైజింగ్ ఇంటరాక్షన్‌ను అనుకరించడానికి రూపొందించబడింది.
కాలిబ్రేటర్లు, నాణ్యత నియంత్రణలు మరియు సీరం లేదా ప్లాస్మా నమూనాలు వ్యక్తిగతంగా పలుచనలో బాగా కలపబడతాయి
చిన్న గొట్టాలలో ఆల్కాట్ చేయబడిన hACE2-HRP సంయోగం కలిగిన బఫర్. అప్పుడు మిశ్రమాలు లోపలికి బదిలీ చేయబడతాయి
స్థిరమైన రీకాంబినెంట్ SARS-CoV-2 RBD ఫ్రాగ్మెంట్ (RBD)ని కలిగి ఉన్న మైక్రోప్లేట్ బావులు
పొదిగే. 30 నిమిషాల పొదిగే సమయంలో, కాలిబ్రేటర్లలోని RBD నిర్దిష్ట యాంటీబాడీ, QC మరియు
బావులలో స్థిరీకరించబడిన RBDని నిర్దిష్ట బైండింగ్ కోసం నమూనాలు hACE2-HRPతో పోటీపడతాయి. తర్వాత
పొదిగే సమయంలో, అన్‌బౌండ్ hACE2-HRP కంజుగేట్‌ను తొలగించడానికి బావులు 4 సార్లు కడుగుతారు. యొక్క పరిష్కారం
TMB అప్పుడు జోడించబడుతుంది మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 20 నిమిషాలు పొదిగేది, ఫలితంగా అభివృద్ధి చెందుతుంది a
నీలం రంగు. 1N HCl చేరికతో రంగు అభివృద్ధి ఆగిపోతుంది మరియు శోషణ ఉంటుంది
స్పెక్ట్రోఫోటోమెట్రిక్‌గా 450 nm వద్ద కొలుస్తారు. ఏర్పడిన రంగు యొక్క తీవ్రత దానికి అనులోమానుపాతంలో ఉంటుంది
ఎంజైమ్ మొత్తం, మరియు అదే విధంగా అంచనా వేసిన ప్రమాణాల మొత్తానికి విలోమ సంబంధం కలిగి ఉంటుంది.
అందించిన కాలిబ్రేటర్‌ల ద్వారా ఏర్పడిన అమరిక వక్రరేఖతో పోల్చడం ద్వారా, ఏకాగ్రత
తెలియని నమూనాలోని తటస్థీకరణ ప్రతిరోధకాలను అప్పుడు లెక్కించబడుతుంది.
【మెటీరియల్స్ అవసరం కానీ అందించబడలేదు】
1. డిస్టిల్డ్ లేదా డీయోనైజ్డ్ వాటర్
2. ప్రెసిషన్ పైపెట్‌లు: 10μL, 100μL,200μL మరియు 1 mL
3. డిస్పోజబుల్ పైపెట్ చిట్కాలు
4. మైక్రోప్లేట్ రీడర్ 450nm వద్ద శోషణను చదవగలదు.
5. శోషక కాగితం
6. గ్రాఫ్ పేపర్
7. వోర్టెక్స్ మిక్సర్ లేదా సమానమైనది
【నమూనా సేకరణ మరియు నిల్వ】
1. K2-EDTA ఉన్న ట్యూబ్‌లలో సేకరించిన సీరం మరియు ప్లాస్మా నమూనాలను ఈ కిట్ కోసం ఉపయోగించవచ్చు.
2. నమూనాలను మూతపెట్టి, 48 గంటల వరకు 2 °C - 8 °C వద్ద నిల్వ చేయడానికి ముందుగా నిల్వ చేయవచ్చు.
ఎక్కువ కాలం (6 నెలల వరకు) ఉంచబడిన నమూనాలను పరీక్షకు ముందు -20 °C వద్ద ఒకసారి మాత్రమే స్తంభింపజేయాలి.
పునరావృతమయ్యే ఫ్రీజ్-థా చక్రాలను నివారించండి.
ప్రోటోకాల్
【రియాజెంట్ తయారీ】
1. అన్ని కారకాలు తప్పనిసరిగా శీతలీకరణ నుండి తీసివేయబడాలి మరియు ఉపయోగం ముందు గది ఉష్ణోగ్రతకు తిరిగి రావడానికి అనుమతించాలి
(20° నుండి 25°C). ఉపయోగించిన వెంటనే రిఫ్రిజిరేటర్‌లో అన్ని రియాజెంట్లను సేవ్ చేయండి.
2. అన్ని నమూనాలు మరియు నియంత్రణలు ఉపయోగించే ముందు వోర్టెక్స్ చేయాలి.
3. hACE2-HRP సొల్యూషన్ తయారీ: hACE2-HRP గాఢతను 1: 51 పలుచన నిష్పత్తిలో పలుచనతో పలుచన చేయండి
బఫర్. ఉదాహరణకు, 100 μL hACE2-HRP గాఢతను 5.0mL HRP డైల్యూషన్ బఫర్‌తో పలుచన చేయండి
HACE2-HRP పరిష్కారాన్ని తయారు చేయండి.
4. 1× వాష్ సొల్యూషన్ తయారీ: 20× వాష్ సొల్యూషన్‌ను డీయోనైజ్డ్ లేదా డిస్టిల్డ్ వాటర్‌తో కరిగించండి
వాల్యూమ్ నిష్పత్తి 1:19. ఉదాహరణకు, 20 mL 20× వాష్ సొల్యూషన్‌ను 380 mL డీయోనైజ్డ్ లేదా
400 mL 1× వాష్ సొల్యూషన్ చేయడానికి స్వేదనజలం.
【పరీక్ష విధానం】
1. ప్రత్యేక ట్యూబ్‌లలో, సిద్ధం చేసిన hACE2-HRP సొల్యూషన్‌లో 120μL ఆల్కాట్.
2. ప్రతి ట్యూబ్‌లో 6 μL కాలిబ్రేటర్లు, తెలియని నమూనాలు, నాణ్యత నియంత్రణలను జోడించి బాగా కలపండి.
3. దశ 2లో తయారు చేసిన ప్రతి మిశ్రమం యొక్క 100μLని సంబంధిత మైక్రోప్లేట్ బావుల్లోకి బదిలీ చేయండి
ముందుగా రూపొందించిన పరీక్ష కాన్ఫిగరేషన్‌కు.
3. ప్లేట్‌ను ప్లేట్ సీలర్‌తో కప్పి, 37°C వద్ద 30 నిమిషాల పాటు పొదిగించండి.
4. ప్లేట్ సీలర్‌ని తీసివేసి, ఒక్కో బావికి దాదాపు 300 μL 1× వాష్ సొల్యూషన్‌తో ప్లేట్‌ను నాలుగు సార్లు కడగాలి.
5. దశలను కడిగిన తర్వాత బావుల్లోని అవశేష ద్రవాన్ని తొలగించడానికి కాగితపు టవల్‌పై ప్లేట్‌ను నొక్కండి.
6. ప్రతి బావికి 100 μL TMB సొల్యూషన్ వేసి, ప్లేట్‌ను చీకటిలో 20 - 25°C వద్ద 20 నిమిషాల పాటు పొదిగించండి.
7. ప్రతిచర్యను ఆపడానికి ప్రతి బావికి 50 μL స్టాప్ సొల్యూషన్ జోడించండి.
8. మైక్రోప్లేట్ రీడర్‌లో 450 nm వద్ద శోషణను 10 నిమిషాల్లో చదవండి (630nm అనుబంధంగా ఉంటుంది
అధిక ఖచ్చితత్వ పనితీరు కోసం సిఫార్సు చేయబడింది).