SARS-CoV-2 நடுநிலையாக்கும் ஆன்டிபாடி கண்டறிதல் கருவி (ELISA)
【கொள்கை】
SARS-CoV-2 நடுநிலையாக்கும் ஆன்டிபாடி கண்டறிதல் கிட் போட்டி ELISA முறையை அடிப்படையாகக் கொண்டது.
சுத்திகரிக்கப்பட்ட ரிசெப்டர் பைண்டிங் டொமைன் (RBD), வைரஸ் ஸ்பைக் (S) புரதத்திலிருந்து புரதம் மற்றும் ஹோஸ்ட் செல் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்துதல்
ஏற்பி ACE2, இந்த சோதனை வைரஸ்-புரவலன் நடுநிலைப்படுத்தும் தொடர்புகளை பிரதிபலிக்கும் வகையில் வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது.
அளவீடுகள், தரக் கட்டுப்பாடுகள் மற்றும் சீரம் அல்லது பிளாஸ்மா மாதிரிகள் தனித்தனியாக நீர்த்தலில் நன்கு கலக்கப்படுகின்றன.
சிறிய குழாய்களில் அலிகோட் செய்யப்பட்ட hACE2-HRP கான்ஜுகேட் கொண்ட தாங்கல். பின்னர் கலவைகள் மாற்றப்படுகின்றன
அசையாத மறுசீரமைப்பு SARS-CoV-2 RBD துண்டு (RBD) கொண்ட மைக்ரோ பிளேட் கிணறுகள்
அடைகாத்தல். 30-நிமிட அடைகாக்கும் போது, RBD குறிப்பிட்ட ஆன்டிபாடி, அளவீடுகளில், QC மற்றும்
கிணறுகளில் அசையாத RBDயை குறிப்பிட்ட பிணைப்பிற்காக மாதிரிகள் hACE2-HRP உடன் போட்டியிடும். பிறகு
அடைகாக்கும் போது, கிணறுகள் 4 முறை கழுவப்பட்டு வரம்பற்ற hACE2-HRP கான்ஜுகேட்டை அகற்றும். ஒரு தீர்வு
TMB பின்னர் சேர்க்கப்பட்டு அறை வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கப்படுகிறது, இதன் விளைவாக a
நீல நிறம். 1N HCl ஐச் சேர்ப்பதன் மூலம் வண்ண வளர்ச்சி நிறுத்தப்படுகிறது, மேலும் உறிஞ்சுதல் ஆகும்
450 nm இல் ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமெட்ரிக் முறையில் அளவிடப்படுகிறது. உருவான நிறத்தின் தீவிரம் விகிதாசாரமாகும்
தற்போதுள்ள நொதியின் அளவு, மற்றும் அதே வழியில் மதிப்பிடப்பட்ட தரநிலைகளின் அளவுடன் நேர்மாறாக தொடர்புடையது.
வழங்கப்பட்ட அளவீடுகளால் உருவாக்கப்பட்ட அளவுத்திருத்த வளைவுடன் ஒப்பிடுவதன் மூலம், செறிவு
அறியப்படாத மாதிரியில் நடுநிலைப்படுத்தும் ஆன்டிபாடிகள் பின்னர் கணக்கிடப்படுகிறது.
【தேவையான பொருட்கள் ஆனால் வழங்கப்படவில்லை】
1. காய்ச்சி வடிகட்டிய அல்லது அயனியாக்கம் செய்யப்பட்ட நீர்
2. துல்லியமான குழாய்கள்: 10μL, 100μL,200μL மற்றும் 1 mL
3. செலவழிப்பு பைப்பட் குறிப்புகள்
4. மைக்ரோபிளேட் ரீடர் 450nm இல் உறிஞ்சும் திறன் கொண்டது.
5. உறிஞ்சும் காகிதம்
6. வரைபடத் தாள்
7. சுழல் கலவை அல்லது அதற்கு சமமான
【மாதிரி சேகரிப்பு மற்றும் சேமிப்பு】
1. K2-EDTA கொண்ட குழாய்களில் சேகரிக்கப்பட்ட சீரம் மற்றும் பிளாஸ்மா மாதிரிகள் இந்தக் கருவிக்கு பயன்படுத்தப்படலாம்.
2. மாதிரிகள் மூடப்பட வேண்டும் மற்றும் 48 மணி நேரம் வரை 2 °C - 8 °C வெப்பநிலையில் சேமிக்கப்படும்.
நீண்ட நேரம் (6 மாதங்கள் வரை) வைத்திருக்கும் மாதிரிகள் மதிப்பீட்டிற்கு முன் -20 °C வெப்பநிலையில் ஒருமுறை மட்டுமே உறைய வைக்கப்பட வேண்டும்.
மீண்டும் மீண்டும் உறைதல்-கரை சுழற்சிகளைத் தவிர்க்கவும்.
நெறிமுறை
【ரீஜென்ட் தயாரிப்பு】
1. அனைத்து உதிரிபாகங்களும் குளிரூட்டலில் இருந்து வெளியே எடுக்கப்பட்டு, பயன்படுத்துவதற்கு முன் அறை வெப்பநிலைக்குத் திரும்ப அனுமதிக்கப்பட வேண்டும்
(20° முதல் 25°C வரை). பயன்பாட்டிற்குப் பிறகு உடனடியாக குளிர்சாதன பெட்டியில் அனைத்து உலைகளையும் சேமிக்கவும்.
2. அனைத்து மாதிரிகள் மற்றும் கட்டுப்பாடுகள் பயன்படுத்துவதற்கு முன் சுழல வேண்டும்.
3. hACE2-HRP தீர்வு தயாரிப்பு: hACE2-HRP செறிவை 1: 51 நீர்த்த விகிதத்தில் நீர்த்துப்போகச் செய்யவும்
தாங்கல். எடுத்துக்காட்டாக, 100 μL hACE2-HRP செறிவை 5.0mL HRP நீர்த்தல் இடையகத்துடன் நீர்த்துப்போகச் செய்யவும்.
HACE2-HRP தீர்வை உருவாக்கவும்.
4. 1× வாஷ் கரைசல் தயாரிப்பு: 20× வாஷ் கரைசலை டீயோனைஸ் செய்யப்பட்ட அல்லது காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரில் நீர்த்துப்போகச் செய்யவும்.
தொகுதி விகிதம் 1:19. எடுத்துக்காட்டாக, 20 மிலி 20× வாஷ் கரைசலை 380 மிலி டீயோனைஸ்டு அல்லது
400 மிலி 1× வாஷ் கரைசல் தயாரிக்க காய்ச்சி வடிகட்டிய நீர்.
【சோதனை நடைமுறை】
1. தனித்தனி குழாய்களில், தயாரிக்கப்பட்ட hACE2-HRP தீர்வு 120μL.
2. ஒவ்வொரு குழாயிலும் 6 μL அளவீடுகள், தெரியாத மாதிரிகள், தரக் கட்டுப்பாடுகள் ஆகியவற்றைச் சேர்த்து நன்கு கலக்கவும்.
3. படி 2 இல் தயாரிக்கப்பட்ட ஒவ்வொரு கலவையிலிருந்தும் 100μLஐ அதனுடன் தொடர்புடைய மைக்ரோ பிளேட் கிணறுகளுக்கு மாற்றவும்
முன் வடிவமைக்கப்பட்ட சோதனை உள்ளமைவுக்கு.
3. ப்ளேட் சீலர் மூலம் தட்டை மூடி, 37 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கவும்.
4. ப்ளேட் சீலரை அகற்றி, ஒரு கிணற்றுக்கு சுமார் 300 μL 1× வாஷ் கரைசல் கொண்டு தட்டை நான்கு முறை கழுவவும்.
5. படிகளை கழுவிய பின் கிணறுகளில் எஞ்சியிருக்கும் திரவத்தை அகற்ற காகித துண்டு மீது தட்டு தட்டவும்.
6. ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 100 μL TMB கரைசலைச் சேர்த்து, 20 நிமிடங்களுக்கு 20 - 25°C வெப்பநிலையில் தட்டை இருட்டில் அடைக்கவும்.
7. எதிர்வினையை நிறுத்த ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் 50 μL ஸ்டாப் கரைசலை சேர்க்கவும்.
8. மைக்ரோ பிளேட் ரீடரில் உள்ள உறிஞ்சுதலை 450 nm இல் 10 நிமிடங்களுக்குள் படிக்கவும் (துணையாக 630nm
அதிக துல்லியமான செயல்திறனுக்காக பரிந்துரைக்கப்படுகிறது).