Kifaa cha Kugundua Kinga Mwili cha SARS-CoV-2 (ELISA)
【KANUNI】
Kifaa cha Kugundua Kingamwili cha SARS-CoV-2 kinatokana na mbinu ya ushindani ya ELISA.
Kwa kutumia kikoa kilichosafishwa cha kipokezi (RBD), protini kutoka kwa protini ya spike ya virusi (S) na seli mwenyeji.
kipokezi ACE2, jaribio hili limeundwa ili kuiga mwingiliano wa kugeuza kienyeji wa virusi.
Vidhibiti, Vidhibiti vya Ubora, na sampuli za seramu au plasma huchanganywa kila moja vizuri katika dilution
bafa iliyo na kiunganishi cha haACE2-HRP kilichotolewa katika mirija midogo. Kisha mchanganyiko huhamishiwa ndani
visima vidogo vilivyo na kipande cha RBD (RBD) kisichohamishika cha SARS-CoV-2
incubation. Wakati wa incubation ya dakika 30, kingamwili maalum ya RBD kwenye vidhibiti, QC na
sampuli zitashindana na haACE2-HRP kwa ajili ya kufunga RBD isiyohamishika kwenye visima. Baada ya
incubation, visima huoshwa mara 4 ili kuondoa conjugate ya HACE2-HRP isiyofungwa. Suluhisho la
TMB huongezwa na kuangaziwa kwa dakika 20 kwenye joto la kawaida, na kusababisha maendeleo ya a
rangi ya bluu. Uendelezaji wa rangi umesimamishwa na kuongeza ya 1N HCl, na kunyonya ni
kipimo spectrophotometrically katika 450 nm. Nguvu ya rangi inayoundwa ni sawia na
kiasi cha kimeng'enya kilichopo, na kinahusiana kinyume na kiasi cha viwango vilivyojaribiwa kwa njia sawa.
Kupitia kulinganisha na curve calibration iliyoundwa na calibrators zinazotolewa, mkusanyiko wa
antibodies za kupunguza katika sampuli isiyojulikana huhesabiwa.
【NYENZO ZINAHITAJIKA LAKINI HAZITOLEWI】
1. Maji yaliyochapwa au yaliyotolewa
2. Vipuli vya usahihi: 10μL, 100μL, 200μL na mL 1
3. Vidokezo vya pipette vinavyoweza kutolewa
4. Kisomaji cha Microplate chenye uwezo wa kusoma kunyonya kwa 450nm.
5. Karatasi ya kunyonya
6. Karatasi ya grafu
7. Mchanganyiko wa Vortex au sawa
【UKUSANYAJI NA UHIFADHI WA VIPINDI】
1. Sampuli za Seramu na Plasma zilizokusanywa katika mirija iliyo na K2-EDTA zinaweza kutumika kwa kifaa hiki.
2. Sampuli zinapaswa kufungwa na zinaweza kuhifadhiwa kwa hadi saa 48 kwa 2 °C - 8 °C kabla ya majaribio.
Sampuli zilizohifadhiwa kwa muda mrefu zaidi (hadi miezi 6) zinapaswa kugandishwa mara moja tu kwa -20 °C kabla ya kufanyiwa majaribio.
Epuka mizunguko ya kufungia mara kwa mara.
PROTOCOL
【Maandalizi ya Reagent】
1. Vitendanishi vyote lazima vitolewe kwenye jokofu na kuruhusiwa kurudi kwenye joto la kawaida kabla ya matumizi
(20° hadi 25°C). Hifadhi vitendanishi vyote kwenye jokofu mara baada ya matumizi.
2. Sampuli zote na vidhibiti vinapaswa kuwa vortexed kabla ya matumizi.
3. HACE2-HRP Matayarisho ya Suluhisho: Punguza mkusanyiko wa haACE2-HRP katika uwiano wa 1: 51 wa dilution na Dilution
Bafa. Kwa mfano, punguza 100 μL ya haACE2-HRP makini na 5.0mL ya HRP Dilution Buffer hadi
tengeneza suluhisho la HACE2-HRP.
4. 1× Osha Suluhisho Matayarisho: Punguza Suluhisho la Kuosha la 20× kwa maji yaliyosafishwa au yaliyotiwa maji kwa kutumia
uwiano wa ujazo wa 1:19. Kwa mfano, punguza mililita 20 za 20× Suluhisho la Osha na mililita 380 za deionized au
maji distilled kufanya 400 ml ya 1× Osha Solution.
【Utaratibu wa Mtihani】
1. Katika mirija tofauti, aliquot 120μL ya Suluhisho la HACE2-HRP lililoandaliwa.
2. Ongeza 6 μL ya calibrators, sampuli zisizojulikana, udhibiti wa ubora katika kila tube na kuchanganya vizuri.
3. Hamisha 100μL ya kila mchanganyiko uliotayarishwa katika hatua ya 2 kwenye visima vya microplate vinavyolingana kulingana na
kwa usanidi wa jaribio ulioundwa mapema.
3. Funika sahani kwa Kifunga Bamba na uangulie kwa joto la 37°C kwa dakika 30.
4. Ondoa Kifunga Bamba na uoshe sahani kwa takriban 300 μL ya 1× Suluhisho la Osha kwa kila kisima kwa mara nne.
5. Gonga sahani kwenye kitambaa cha karatasi ili kuondoa kioevu kilichobaki kwenye visima baada ya hatua za kuosha.
6. Ongeza 100 μL ya Suluhisho la TMB kwa kila kisima na uangulie sahani kwenye giza kwa 20 - 25°C kwa dakika 20.
7. Ongeza 50 μL ya Stop Solution kwa kila kisima ili kusimamisha majibu.
8. Soma kifyonzaji katika kisomaji cha mikroplate kwa 450 nm ndani ya dakika 10 (630nm kama nyongeza ni
ilipendekeza kwa utendaji wa usahihi wa juu).