SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit (ELISA)
【PRINCIP】
SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit är baserat på konkurrerande ELISA-metod.
Genom att använda renad receptorbindande domän (RBD), protein från viral spike (S) protein och värdcellen
receptor ACE2, är detta test utformat för att efterlikna den neutraliserande interaktionen mellan virus och värd.
Kalibratorer, kvalitetskontroller och serum- eller plasmaprover blandas individuellt väl i spädning
buffert innehållande hACE2-HRP-konjugat alikvoterat i små rör.Sedan överförs blandningarna in
mikroplattans brunnar som innehåller immobiliserat rekombinant SARS-CoV-2 RBD-fragment (RBD) för
inkubation.Under den 30 minuter långa inkubationen, den RBD-specifika antikroppen i kalibratorerna, QC och
prover kommer att konkurrera med hACE2-HRP för specifik bindning av RBD immobiliserad i brunnarna.Efter
inkubationen tvättas brunnarna 4 gånger för att avlägsna obundet hACE2-HRP-konjugat.En lösning av
TMB tillsätts sedan och inkuberas i 20 minuter vid rumstemperatur, vilket resulterar i utvecklingen av en
blå färg.Färgutvecklingen stoppas med tillsats av IN HCl, och absorbansen är
mätt spektrofotometriskt vid 450 nm.Intensiteten hos den bildade färgen är proportionell mot
mängd enzym närvarande, och är omvänt relaterat till mängden standarder som analyserats på samma sätt.
Genom jämförelse med kalibreringskurvan som bildas av de medföljande kalibratorerna kan koncentrationen av
neutraliserande antikroppar i det okända provet beräknas sedan.
【MATERIAL KRÄVS MEN EJ TILLHANDAHÅLLS】
1. Destillerat eller avjoniserat vatten
2. Precisionspipetter: 10μL, 100μL, 200μL och 1 mL
3. Engångspipettspetsar
4. Mikroplattläsare som kan läsa av absorbans vid 450 nm.
5. Absorberande papper
6. Grafpapper
7. Vortexmixer eller motsvarande
【PROVINSAMLING OCH FÖRVARING】
1. Serum- och plasmaprover som samlats in i rör som innehåller K2-EDTA kan användas för detta kit.
2. Proverna ska ha lock och kan förvaras i upp till 48 timmar vid 2 °C - 8 °C innan analysen påbörjas.
Prover som hålls under en längre tid (upp till 6 månader) bör endast frysas en gång vid -20 °C före analys.
Undvik upprepade frys-upptiningscykler.
PROTOKOLL
【Reagensberedning】
1. Alla reagenser måste tas ut ur kylen och tillåtas återgå till rumstemperatur före användning
(20° till 25°C).Spara alla reagenser i kylskåp omedelbart efter användning.
2. Alla prover och kontroller ska vortexas före användning.
3. Beredning av hACE2-HRP-lösning: Späd ut hACE2-HRP-koncentrat med utspädningsförhållandet 1:51 med utspädning
Buffert.Späd till exempel 100 μL hACE2-HRP-koncentrat med 5,0 mL HRP-spädningsbuffert för att
göra en hACE2-HRP-lösning.
4. 1× tvättlösningsberedning: Späd 20× tvättlösningen med avjoniserat eller destillerat vatten med en
volymförhållande på 1:19.Späd till exempel 20 mL 20× tvättlösning med 380 mL avjoniserat eller
destillerat vatten för att göra 400 ml 1× tvättlösning.
【Test procedur】
1. Prova 120 μL av den beredda hACE2-HRP-lösningen i separata rör.
2. Tillsätt 6 μL kalibratorer, okända prover, kvalitetskontroller i varje rör och blanda väl.
3. Överför 100 μL av varje blandning som bereddes i steg 2 till motsvarande mikroplattbrunnar enligt
till fördesignad testkonfiguration.
3. Täck plattan med Plate Sealer och inkubera vid 37°C i 30 minuter.
4. Ta bort plattförseglaren och tvätta plattan med cirka 300 μL 1× tvättlösning per brunn i fyra gånger.
5. Knacka plattan på en pappershandduk för att avlägsna kvarvarande vätska i brunnarna efter tvättstegen.
6. Tillsätt 100 μL TMB-lösning till varje brunn och inkubera plattan i mörker vid 20 - 25 °C i 20 minuter.
7. Tillsätt 50 μL stopplösning till varje brunn för att stoppa reaktionen.
8. Läs av absorbansen i mikroplattläsaren vid 450 nm inom 10 minuter (630 nm som tillbehör är
rekommenderas för högre precision).
