Комплет за детекцију неутралишућих антитела САРС-ЦоВ-2 (ЕЛИСА)
【ПРИНЦИП】
Комплет за детекцију неутрализујућих антитела САРС-ЦоВ-2 заснован је на компетитивној ЕЛИСА методологији.
Коришћењем пречишћеног домена за везивање рецептора (РБД), протеина из протеина вирусног шиљка (С) и ћелије домаћина
рецептор АЦЕ2, овај тест је дизајниран да опонаша интеракцију неутрализације вируса и домаћина.
Калибратори, контроле квалитета и узорци серума или плазме се појединачно добро мешају у разблажењу
пуфер који садржи хАЦЕ2-ХРП коњугат аликвот у малим епруветама. Затим се смеше пребацују унутра
јажице микроплоче које садрже имобилисани рекомбинантни САРС-ЦоВ-2 РБД фрагмент (РБД) за
инкубација. Током 30-минутне инкубације, РБД специфично антитело у калибраторима, КЦ и
узорци ће се такмичити са хАЦЕ2-ХРП за специфично везивање РБД имобилисаног у бунарима. После
током инкубације, отворе се оперу 4 пута да би се уклонио невезани хАЦЕ2-ХРП коњугат. Решење за
Затим се додаје ТМБ и инкубира 20 минута на собној температури, што резултира развојем а
плава боја. Развој боје се зауставља додатком 1Н ХЦл, а апсорбанција је
мерено спектрофотометријски на 450 нм. Интензитет формиране боје је пропорционалан
количина присутног ензима, и обрнуто је повезана са количином стандарда анализираних на исти начин.
Поређењем са калибрационом кривом коју формирају обезбеђени калибратори, концентрација од
затим се израчунавају неутрализујућа антитела у непознатом узорку.
【ПОТРЕБНИ МАТЕРИЈАЛИ АЛИ НИЈЕ ОБЕЗБЕЂЕНИ】
1. Дестилована или дејонизована вода
2. Прецизне пипете: 10 μЛ, 100 μЛ, 200 μЛ и 1 мЛ
3. Врхови пипета за једнократну употребу
4. Читач микроплоча способан да очита апсорпцију на 450 нм.
5. Упијајући папир
6. Грамофонски папир
7. Вртложни миксер или еквивалентан
【ПРИКУПЉАЊЕ И СКЛАДИШТЕЊЕ УЗОРАКА】
1. Узорци серума и плазме прикупљени у епруветама које садрже К2-ЕДТА могу се користити за овај комплет.
2. Узорци треба да буду затворени и могу се чувати до 48 сати на 2 °Ц - 8 °Ц пре анализе.
Узорке који се држе дуже (до 6 месеци) треба замрзнути само једном на -20 °Ц пре анализе.
Избегавајте поновљене циклусе замрзавања-одмрзавања.
ПРОТОКОЛ
【Припрема реагенса】
1. Сви реагенси се морају извадити из фрижидера и оставити да се врате на собну температуру пре употребе
(20° до 25°Ц). Све реагенсе чувајте у фрижидеру одмах након употребе.
2. Све узорке и контроле треба промешати пре употребе.
3. Припрема раствора хАЦЕ2-ХРП: Разблажите хАЦЕ2-ХРП концентрат у размери разблажења 1:51 са разблаживањем
Буффер. На пример, разблажите 100 μЛ хАЦЕ2-ХРП концентрата са 5,0 мЛ ХРП пуфера за разблаживање да бисте
направите раствор хАЦЕ2-ХРП.
4. Припрема 1× раствора за прање: Разблажите 20× раствор за прање дејонизованом или дестилованом водом помоћу
однос запремине 1:19. На пример, разблажите 20 мЛ 20× раствора за прање са 380 мЛ дејонизованог или
дестиловане воде да се направи 400 мЛ 1× раствора за прање.
【Тест Процедуре】
1. У одвојеним епруветама, аликвот од 120 μЛ припремљеног раствора хАЦЕ2-ХРП.
2. Додајте 6 μЛ калибратора, непознатих узорака, контроле квалитета у сваку епрувету и добро промешајте.
3. Пренесите 100 μЛ сваке смеше припремљене у кораку 2 у одговарајуће јажице микроплоче према
на унапред дизајнирану тест конфигурацију.
3. Покријте плочу са Плате Сеалер-ом и инкубирајте на 37°Ц 30 минута.
4. Уклоните заптивач за плоче и оперите плочу са приближно 300 μЛ 1× раствора за прање по бунарчићу четири пута.
5. Куцните тањир о папирни пешкир да бисте уклонили преосталу течност из удубљења након корака прања.
6. Додајте 100 μЛ раствора ТМБ у сваки бунар и инкубирајте плочу у мраку на 20 - 25°Ц 20 минута.
7. Додајте 50 μЛ Стоп раствора у сваки бунар да зауставите реакцију.
8. Очитајте апсорбанцију у читачу микроплочица на 450 нм у року од 10 минута (630 нм као додатак
препоручује се за веће перформансе прецизности).