САРС-ЦОВ-2 Неутрализујуће детекције антитела (ЕЛИСА)
【Принцип】
САРС-Цов-2 Неутрализујуће за откривање антитела заснован је на конкурентној ЕЛИСА методологији.
Користећи пречишћени домен везивања рецептора (РБД), протеина из протеина вирусних шиљака и ћелије домаћина
Рецептор Аце2, овај тест је осмишљен да опонаша интеракцију у неутрализацији вируса.
Калибратори, контроле квалитета и узораци серума или плазме појединачно се мешају у разблаживању
Пуфер који садржи ХАЦЕ2-ХРП коњугат аликвоо је у малим цевима. Тада се мешавине преносе у
МИЦРОПЛАТЕ МУЛС који садрже имобилизоване рекомбинантне САРС-ЦОВ-2 РБД фрагмент (РБД) за
Инкубација. Током 30-минутне инкубације, РБД специфично антитело у калибраторима, КЦ и
Узорци ће се такмичити са Хаце2-ХРП за специфично везивање РБД имобилисано у ВРЛС-у. После
Инкубација, бунари се исперу 4 пута да се уклоне невезани ХАЦЕ2-ХРП коњугат. Раствор
ТМБ се затим дода и инкубира на 20 минута на собној температури, што резултира развојем а
Плава боја. Развој боје заустављен је са додатком 1Н ХЦл и апсорбанција је
мерено спектрофотометријски на 450 нм. Интензитет формираног боје пропорционалан је
Количина присутности ензима и обрнуто је повезана са количином стандарда који су на исти начин.
Кроз поређење са кривуље калибрације формираних од стране предвиђених калибратора, концентрација
Затим се израчунавају неутрализација антитела у непознатом узорку.
【Потребни материјали, али нису дате】
1. дестилована или деионизирана вода
2 Прецизни пипете: 10 уЛ, 100 μл, 200 μл и 1 мл
3. Савјети за једнократну пипету
4. Микроплатни читач који је способан за прочитавање апсорбанције на 450нм.
5. упијајући папир
6 Графички папир
7. Вортек миксер или еквивалент
【Прикупљање и складиштење узорка】
1. Узорци серума и плазме прикупљени у цевима које садрже К2-ЕДТА могу се користити за овај комплет.
2 Узорци треба да буду ограничени и могу се чувати до 48 сати на 2 ° Ц - 8 ° Ц пре испитивања.
Узорци који се држе дуже време (до 6 месеци) треба да буду замрзнути само једном на -20 ° Ц пре испитивања.
Избегавајте поновљене циклусе замрзавања одмрзавања.
Протокол
【Припрема реагенса】
1. Сви реагенси морају се изузети из хлађења и оставити се да се врате на собну температуру пре употребе
(20 ° до 25 ° Ц). Спасите све реагенсе у фрижидеру одмах након употребе.
2 Сви узорци и контроле требају бити вртложни пре употребе.
3. Припрема раствора Хаце2-ХРП: Разблаживање Хаце2-ХРП концентрат на 1: 51 однос разблаживања разблаживања
Буффер. На пример, разблажите 100 ул хаце2-ХРП концентрата са 5,0 мл заштите за разблаживање ХРП-а на
Направите хаце2-ХРП раствор.
4. 1 × прање препарата за прање: разблажите раствор од 20 × прање са деионизираном или дестилованом водом са а
Однос јачине звука 1:19. На пример, разблажите 20 мл раствора за прање од 20 мл са 380 мл деионизованог или
Дестилована вода да направи 400 мл 1 × прање решења.
【Поступак испитивања】
1. У засебним цевима, аликвот 120 ул припремљеног раствора хаже2-ХРП.
2 Додајте 6 ул калибратора, непознате узорке, контроле квалитета у свакој цеви и добро мешати.
3. Пренос 100 ул сваке смеше припремљено у кораку 2 у одговарајуће микроплате бунаре према
да предодређене конфигурације теста.
3. Покријте плочу са заштитним плочама и инкубирајте на 37 ° Ц током 30 минута.
4. Уклоните заптивач плоче и оперите тањир са приближно 300 ул раствора за прање по добро за добро.
5. Додирните плочу на папирним пешкиром да бисте уклонили преосталу течност у јажицама након корака прања.
6 Додајте 100 ул ТМБ раствора за сваки бунар и инкубирајте тањир у тами на 20 - 25 ° Ц током 20 минута.
7. Додајте 50 уЛ решења за заустављање у сваку бунар да зауставите реакцију.
8 Прочитајте апсорбанцију у читач микроплата на 450 нМ у року од 10 минута (630нм као додатна опрема је
Препоручује се за веће прецизне перформансе).