Kompleti i zbulimit të antitrupave neutralizues SARS-CoV-2 (ELISA)
【PARIMI】
Kompleti i zbulimit të antitrupave neutralizues SARS-CoV-2 bazohet në metodologjinë konkurruese ELISA.
Duke përdorur domenin e purifikuar të lidhjes së receptorit (RBD), proteina nga proteina e majës virale (S) dhe qeliza pritëse
receptori ACE2, ky test është krijuar për të imituar ndërveprimin neutralizues virus-host.
Kalibrat, kontrollet e cilësisë dhe mostrat e serumit ose plazmës përzihen individualisht mirë në hollim
tampon që përmban konjugat hACE2-HRP të alikutuar në tuba të vegjël. Pastaj përzierjet transferohen brenda
puset e mikropllakës që përmbajnë fragment të imobilizuar rekombinant SARS-CoV-2 RBD (RBD) për
inkubacioni. Gjatë inkubacionit 30-minutësh, antitrupi specifik i RBD në kalibrat, QC dhe
mostrat do të konkurrojnë me hACE2-HRP për lidhjen specifike të RBD të imobilizuar në puse. Pas
gjatë inkubacionit, puset lahen 4 herë për të hequr konjugatin e palidhur hACE2-HRP. Një zgjidhje e
Më pas shtohet TMB dhe inkubohet për 20 minuta në temperaturën e dhomës, duke rezultuar në zhvillimin e a
ngjyrë blu. Zhvillimi i ngjyrës ndalet me shtimin e 1N HCl, dhe absorbimi është
e matur në mënyrë spektrofotometrike në 450 nm. Intensiteti i ngjyrës së formuar është proporcional me
sasia e enzimës e pranishme dhe është e lidhur në mënyrë të kundërt me sasinë e standardeve të analizuara në të njëjtën mënyrë.
Nëpërmjet krahasimit me kurbën e kalibrimit të formuar nga kalibratorët e ofruar, përqendrimi i
më pas llogariten antitrupat neutralizues në kampionin e panjohur.
【MATERIALET E KUJTUARA POR NUK SIGUROHEN】
1. Ujë i distiluar ose i dejonizuar
2. Pipeta precize: 10μL, 100μL,200μL dhe 1 mL
3. Këshilla për pipetën e disponueshme
4. Lexues i mikropllakës i aftë për të lexuar thithjen në 450 nm.
5. Letër absorbuese
6. Letër grafiku
7. Përzierës Vortex ose ekuivalent
【MBLEDHJA DHE RUAJTJA E EKSPOZIMEVE】
1. Mostrat e serumit dhe plazmës të mbledhura në tuba që përmbajnë K2-EDTA mund të përdoren për këtë komplet.
2. Mostrat duhet të mbyllen me kapak dhe mund të ruhen deri në 48 orë në 2 °C - 8 °C përpara se të analizohen.
Mostrat e mbajtura për një kohë më të gjatë (deri në 6 muaj) duhet të ngrihen vetëm një herë në -20 °C përpara analizës.
Shmangni ciklet e përsëritura të ngrirjes-shkrirjes.
PROTOKOLL
【Përgatitja e reagentit】
1. Të gjithë reagentët duhet të nxirren nga frigoriferi dhe të lihen të kthehen në temperaturën e dhomës përpara përdorimit
(20° deri 25°C). Ruani të gjithë reagentët në frigorifer menjëherë pas përdorimit.
2. Të gjitha mostrat dhe kontrollet duhet të rrotullohen përpara përdorimit.
3. Tretësira hACE2-HRP Përgatitja: Holloni koncentratin hACE2-HRP në raport hollimi 1:51 me Hollim
Tampon. Për shembull, holloni 100 μL koncentrat hACE2-HRP me 5.0 ml tampon hollimi HRP në
bëni një zgjidhje hACE2-HRP.
4. 1× Solution larës Përgatitja: Holloni tretësirën larëse 20× me ujë të dejonizuar ose të distiluar me një
raporti i volumit 1:19. Për shembull, holloni 20 ml tretësirë larës 20× me 380 ml të deionizuar ose
ujë të distiluar për të bërë 400 mL tretësirë larës 1×.
【Procedura e testimit】
1. Në tuba të veçantë, 120 μL të tretësirës së përgatitur hACE2-HRP.
2. Shtoni 6 μL kalibratorë, mostra të panjohura, kontrolle të cilësisë në çdo tub dhe përzieni mirë.
3. Transferoni 100 μL të secilës përzierje të përgatitur në hapin 2 në puset përkatëse të mikropllakës sipas
në konfigurimin e testimit të paracaktuar.
3. Mbulojeni pjatën me Plate Sealer dhe inkuboni në 37°C për 30 minuta.
4. Hiqeni vulosjen e pllakës dhe lani pjatën me afërsisht 300 μL tretësirë larës 1× për pus për katër herë.
5. Prekni pjatën në peshqir letre për të hequr lëngun e mbetur në puset pas hapave të larjes.
6. Shtoni 100 μL tretësirë TMB në secilën pus dhe inkuboni pjatën në errësirë në 20 - 25°C për 20 minuta.
7. Shtoni 50 μL tretësirë ndaluese në çdo pus për të ndaluar reaksionin.
8. Lexoni absorbimin në lexuesin e mikropllakës në 450 nm brenda 10 minutave (630 nm si aksesor është
rekomandohet për performancë më të saktë).