Komplet za odkrivanje nevtralizirajočih protiteles SARS-CoV-2 (ELISA)
【NAČELO】
Komplet za odkrivanje nevtralizirajočih protiteles SARS-CoV-2 temelji na konkurenčni metodologiji ELISA.
Z uporabo očiščene receptorske vezavne domene (RBD), proteina iz proteina virusne konice (S) in gostiteljske celice
receptorja ACE2, je ta test zasnovan tako, da posnema nevtralizirajočo interakcijo med virusom in gostiteljem.
Kalibratorji, kontrole kakovosti in vzorci seruma ali plazme se posamično dobro premešajo v razredčitvi.
pufer, ki vsebuje alikvote konjugata hACE2-HRP v majhnih epruvetah. Nato se mešanice prenesejo
vdolbinice mikroplošče, ki vsebujejo imobiliziran rekombinantni fragment SARS-CoV-2 RBD (RBD) za
inkubacija. Med 30-minutno inkubacijo so RBD specifična protitelesa v kalibratorjih, QC in
vzorci bodo tekmovali s hACE2-HRP za specifično vezavo RBD, imobiliziranega v vdolbinicah. Po
med inkubacijo se vdolbinice 4-krat sperejo, da se odstrani nevezani konjugat hACE2-HRP. Rešitev za
Nato dodamo TMB in inkubiramo 20 minut pri sobni temperaturi, kar povzroči razvoj a
modra barva. Razvoj barve se z dodatkom 1N HCl ustavi, absorbanca pa
izmerjeno spektrofotometrično pri 450 nm. Intenzivnost nastale barve je sorazmerna z
količina prisotnega encima in je obratno sorazmerna s količino standardov, testiranih na enak način.
S primerjavo z umeritveno krivuljo, ki jo oblikujejo priloženi kalibratorji, se koncentracija
nato se izračunajo nevtralizirajoča protitelesa v neznanem vzorcu.
【ZAHTEVAN MATERIAL, A NI PRILOŽEN】
1. Destilirana ali deionizirana voda
2. Natančne pipete: 10 μL, 100 μL, 200 μL in 1 ml
3. Konice pipet za enkratno uporabo
4. Čitalnik mikroplošč z možnostjo odčitavanja absorbance pri 450 nm.
5. Vpojni papir
6. Grafični papir
7. Vortex mešalnik ali enakovreden
【ZBIRANJE IN SHRANJEVANJE VZORCEV】
1. Za ta komplet lahko uporabite vzorce seruma in plazme, zbrane v epruvetah, ki vsebujejo K2-EDTA.
2. Vzorci morajo biti zaprti in se lahko pred testiranjem hranijo do 48 ur pri 2 °C - 8 °C.
Vzorce, ki jih hranimo dlje časa (do 6 mesecev), je treba zamrzniti samo enkrat pri -20 °C pred analizo.
Izogibajte se ponavljajočim se ciklom zamrzovanja in odmrzovanja.
PROTOKOL
【Priprava reagenta】
1. Vse reagente je treba pred uporabo vzeti iz hladilnika in pustiti, da se vrnejo na sobno temperaturo
(20° do 25°C). Vse reagente takoj po uporabi shranite v hladilniku.
2. Vse vzorce in kontrole je treba pred uporabo vrtinčiti.
3. Priprava raztopine hACE2-HRP: koncentrat hACE2-HRP razredčite v razmerju redčenja 1:51 z razredčitvijo
Medpomnilnik. Na primer, razredčite 100 μl koncentrata hACE2-HRP s 5,0 ml pufra za redčenje HRP, da
naredite raztopino hACE2-HRP.
4. Priprava 1× izpiralne raztopine: 20× izpiralno raztopino razredčite z deionizirano ali destilirano vodo z
prostorninsko razmerje 1:19. Na primer, razredčite 20 ml 20 × raztopine za izpiranje s 380 ml deioniziranega ali
destilirane vode, da pripravite 400 ml 1 × raztopine za izpiranje.
【Testni postopek】
1. V ločene epruvete alikvotirajte 120 μL pripravljene raztopine hACE2-HRP.
2. V vsako epruveto dodajte 6 μL kalibratorjev, neznanih vzorcev, kontrol kakovosti in dobro premešajte.
3. Prenesite 100 μL vsake zmesi, pripravljene v koraku 2, v ustrezne vdolbinice mikroplošče v skladu z
na vnaprej oblikovano preskusno konfiguracijo.
3. Ploščo pokrijte s tesnilom za plošče in inkubirajte 30 minut pri 37 °C.
4. Odstranite tesnilo za ploščo in štirikrat sperite ploščo s približno 300 μL 1 × raztopine za izpiranje na vdolbino.
5. Ploščo potrkajte po papirnati brisači, da odstranite ostanke tekočine v vdolbinicah po korakih pranja.
6. Dodajte 100 μL raztopine TMB v vsako vdolbinico in ploščo inkubirajte 20 minut v temi pri 20–25 °C.
7. V vsako vdolbino dodajte 50 μL raztopine za zaustavitev, da ustavite reakcijo.
8. Odčitajte absorbanco v bralniku mikroplošč pri 450 nm v 10 minutah (630 nm kot dodatek je
priporočljivo za večjo natančnost).