SARS-CoV-2 Nevtralizirajoči komplet za odkrivanje protiteles (ELISA)
【Načelo】
Komplet za odkrivanje protiteles SARS-Cov-2 temelji na konkurenčni metodologiji ELISA.
Z uporabo prečiščene domene vezave receptorjev (RBD), beljakovine iz virusnega beljakovin in gostiteljske celice
Receptor ACE2, ta test je zasnovan tako, da posnema interakcijo nevtralizacijske interakcije virusa.
Kalibratorji, nadzor kakovosti in vzorci v serumu ali plazmi se v redčenju dobro mešajo
HAMP, ki vsebuje konjugat Hace2-HRP alikvotirano v majhnih cevi. Potem se mešanice prenesejo
vrtine mikro plošč, ki vsebujejo imobilizirani rekombinantni fragment RBD SARS-CoV-2 (RBD) za
inkubacija. Med 30-minutno inkubacijo je protitelo RBD specifično v kalibratorjih, QC in
Vzorci bodo tekmovali s HACE2-HRP za specifično vezavo RBD imobilizirane v vrtinah. Po
Inkubacija, vrtine izperemo 4-krat, da odstranimo nevezani konjugat HACE2-HRP. Rešitev
Nato se TMB doda in inkubira 20 minut pri sobni temperaturi, kar ima za posledico razvoj a
modra barva. Razvoj barve se ustavi z dodatkom 1N HCl in absorbanca je
izmerjeno spektrofotometrično pri 450 nm. Intenzivnost nastale barve je sorazmerna
Količina encima, ki je prisotna in je obratno povezana s količino standardov, ki jih preskušajo na enak način.
S primerjavo s kalibracijsko krivuljo, ki jo tvorijo določeni kalibratorji, koncentracija
Nato se izračuna nevtralizirajoča protitelesa v neznanem vzorcu.
【Potrebni materiali, vendar niso zagotovljeni】
1. destilirana ali deionizirana voda
2. natančne pipete: 10 μl, 100 μl, 200 μl in 1 ml
3. Nasveti za enkratno uporabo pipete
4. bralnik mikroplov, ki lahko prebere absorbanco pri 450nm.
5. Absorbent papir
6. graf papir
7. vrtinčni mešalnik ali enakovreden
【Zbiranje in shranjevanje vzorcev】
1. Vzorci v serumu in plazmi, zbrani v cevi, ki vsebujejo K2-EDTA, se lahko uporabijo za ta komplet.
2. Vzorci morajo biti omejeni in jih je mogoče shraniti do 48 ur pri 2 ° C - 8 ° C pred testom.
Vzorci, ki se zadržujejo dlje časa (do 6 mesecev), je treba pred testom zamrzniti le enkrat pri -20 ° C.
Izogibajte se večkratnim cikli zamrzovalne odmrzovanja.
Protokol
【Priprava reagenta】
1. Vse reagente je treba odvzeti iz hladilnika in se pred uporabo vrniti na sobno temperaturo
(20 ° do 25 ° C). Po uporabi takoj shranite vse reagente v hladilniku.
2. Vsi vzorci in kontrole je treba pred uporabo vrtinčenje.
3. HACE2-HRP Priprava raztopine: Conncent Hace2-HRP razredči pri razmerju razredčitve 1: 51 z redčenjem
Pufer. Na primer, razredčite 100 μl koncentrata HACE2-HRP s 5,0 ml pufra za redčenje HRP do
Naredite rešitev Hace2-HRP.
4. Priprava raztopine 1 × Oparajte raztopino 20 × Upravna raztopina z deionizirano ali destilirano vodo z a
Razmerje glasnosti 1:19. Na primer, razredčite 20 ml raztopine 20 × pranja s 380 ml deioniziranega ali
Destilirana voda, ki naredi 400 ml raztopine 1 × pranja.
【Preskusni postopek】
1. v ločenih ceveh alikvot 120 μl pripravljene raztopine HACE2-HRP.
2. Dodajte 6 μl kalibratorjev, neznanih vzorcev, kontrole kakovosti v vsaki cevi in dobro premešajte.
3. Prenesite 100 μl vsake mešanice, pripravljene v koraku 2 v ustrezne mikroplastne vrtine v skladu
do vnaprej podpisane testne konfiguracije.
3. Plošče pokrijte s tesnilnim materialom in 30 minut inkubirajte pri 37 ° C.
4. Odstranite tesnilno ploščo in ploščo sperite s približno 300 μl raztopine 1 × pralne raztopine na dobro štirikrat.
5. Tapnite ploščo na papirni brisači, da po umivanju odstranite preostalo tekočino v vrtinah.
6. dodajte 100 μl raztopine TMB v vsako vrtino in ploščo inkubirajte v temi pri 20 - 25 ° C 20 minut.
7. Dodajte 50 μl raztopine za zaustavitev vsakemu vdolbinici, da zaustavite reakcijo.
8. V 10 minutah preberite absorbanco v čitalniku mikroplat pri 450 nm (630nm kot dodatna oprema
Priporočljivo za večjo natančnost).