Súprava na detekciu neutralizačných protilátok SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINCÍP】
Súprava na detekciu neutralizačných protilátok SARS-CoV-2 je založená na konkurenčnej metodológii ELISA.
Pomocou purifikovanej receptorovej väzbovej domény (RBD), proteínu z vírusového spike (S) proteínu a hostiteľskej bunky
receptor ACE2, je tento test navrhnutý tak, aby napodobňoval neutralizačné interakcie vírus-hostiteľ.
Kalibrátory, kontroly kvality a vzorky séra alebo plazmy sa jednotlivo dobre premiešajú v riedení
pufor obsahujúci hACE2-HRP konjugát alikvotný v malých skúmavkách. Potom sa zmesi prenesú dovnútra
jamky mikroplatničky obsahujúce imobilizovaný rekombinantný SARS-CoV-2 RBD fragment (RBD) pre
inkubácia. Počas 30-minútovej inkubácie sa RBD špecifická protilátka v kalibrátoroch, QC a
vzorky budú súťažiť s hACE2-HRP o špecifickú väzbu RBD imobilizovaného v jamkách. Po
po inkubácii sa jamky 4-krát premyjú, aby sa odstránil nenaviazaný hACE2-HRP konjugát. Riešenie
Potom sa pridá TMB a inkubuje sa 20 minút pri teplote miestnosti, čo vedie k rozvoju a
modrá farba. Vyvíjanie farby sa zastaví pridaním 1N HCl a absorbancia sa upraví
merané spektrofotometricky pri 450 nm. Intenzita vytvorenej farby je úmerná
množstvo prítomného enzýmu a je nepriamo úmerné množstvu štandardov testovaných rovnakým spôsobom.
Porovnaním s kalibračnou krivkou vytvorenou dodanými kalibrátormi sa koncentrácia
potom sa vypočítajú neutralizačné protilátky v neznámej vzorke.
【MATERIÁLY POTREBNÉ, ALE NIE SÚ DODÁVANÉ】
1. Destilovaná alebo deionizovaná voda
2. Presné pipety: 10μL, 100μL, 200μL a 1 ml
3. Jednorazové špičky pipiet
4. Čítačka mikrodoštičiek schopná čítať absorbanciu pri 450 nm.
5. Nasiakavý papier
6. Grafický papier
7. Vortexový mixér alebo ekvivalent
【ODBER A SKLADOVANIE VZORIEK】
1. Pre túto súpravu možno použiť vzorky séra a plazmy odobraté do skúmaviek obsahujúcich K2-EDTA.
2. Vzorky by mali byť uzavreté a pred testovaním môžu byť skladované až 48 hodín pri teplote 2 °C – 8 °C.
Vzorky uchovávané dlhší čas (až 6 mesiacov) by sa mali pred testom zmraziť iba raz na -20 °C.
Vyhnite sa opakovaným cyklom zmrazovania a rozmrazovania.
PROTOKOL
【Príprava činidla】
1. Všetky reagencie musia byť pred použitím vybraté z chladničky a ponechané ochladiť na izbovú teplotu
(20 až 25 °C). Všetky reagencie ihneď po použití uložte do chladničky.
2. Všetky vzorky a kontroly by sa mali pred použitím premiešať na vortexe.
3. Príprava roztoku hACE2-HRP: Zrieďte koncentrát hACE2-HRP v pomere riedenia 1:51 s riedením
Buffer. Napríklad zrieďte 100 μl koncentrátu hACE2-HRP s 5,0 ml riediaceho pufra HRP na
pripravte roztok hACE2-HRP.
4. Príprava 1x premývacieho roztoku: Zrieďte 20x premývací roztok deionizovanou alebo destilovanou vodou s
objemový pomer 1:19. Napríklad zrieďte 20 ml 20× premývacieho roztoku s 380 ml deionizovaného alebo
destilovanej vody, aby sa vyrobilo 400 ml 1× premývacieho roztoku.
【Postup testu】
1. Do samostatných skúmaviek alikvotne nalejte 120 μl pripraveného roztoku hACE2-HRP.
2. Do každej skúmavky pridajte 6 μl kalibrátorov, neznámych vzoriek, kontroly kvality a dobre premiešajte.
3. Preneste 100 μl každej zmesi pripravenej v kroku 2 do príslušných jamiek mikroplatničky podľa pokynov
na vopred navrhnutú testovaciu konfiguráciu.
3. Doštičku prikryte utesňovačom platní a inkubujte pri teplote 37 °C počas 30 minút.
4. Odstráňte tesniaci prostriedok platní a štyrikrát premyte platňu približne 300 μl 1× premývacieho roztoku na jamku.
5. Po premývaní poklepte platňou na papierovú utierku, aby ste odstránili zvyškovú tekutinu v jamkách.
6. Pridajte 100 μl roztoku TMB do každej jamky a doštičku inkubujte v tme pri teplote 20 – 25 °C počas 20 minút.
7. Pridajte 50 μl zastavovacieho roztoku do každej jamky na zastavenie reakcie.
8. Odčítajte absorbanciu na čítačke mikrodoštičiek pri 450 nm do 10 minút (630 nm ako príslušenstvo
odporúčané pre vyššiu presnosť výkonu).