SARS-COV-2 neutralizujúca súprava protilátok (ELISA)
【Zásada】
Súprava detekcie protilátok SARS-CoV-2 je založená na konkurenčnej metodológii ELISA.
Použitím purifikovanej domény viažucej receptorov (RBD), proteín z proteínu vírusového hrotu (S) a hostiteľských buniek
Receptor ACE2, tento test je navrhnutý tak, aby napodobňoval neutralizačnú interakciu vírusom a hostiteľom.
Kalibrátory, kontroly kvality a vzorky séra alebo plazmy sa v riedení dobre premiešajú individuálne
Túffer obsahujúci HACE2-HRP konjugát alikkotovaný v malých skúmavkách. Potom sa zmesi prenášajú v
Mikroplatné jamky obsahujúce imobilizovaný rekombinantný fragment SARS-COV-2 RBD (RBD) pre
inkubácia. Počas 30-minútovej inkubácie, RBD špecifická protilátka v kalibrátoroch, QC a
Vzorky budú konkurovať HACE2-HRP na špecifickú väzbu RBD imobilizovanú v jamkách. Po
Inkubácia, jamky sa premyjú štyrikrát, aby sa odstránil neviazaný konjugát HACE2-HRP. Roztok
TMB sa potom pridá a inkubuje sa 20 minút pri teplote miestnosti, čo vedie k vývoju a
Modrá farba. Vývoj farieb sa zastaví pridaním 1N HCI a absorbancia je
merané spektrofotometricky pri 450 nm. Intenzita vytvorenej farby je úmerná
Množstvo prítomného enzýmu a nepriamo súvisí s množstvom štandardov testovaných rovnakým spôsobom.
Porovnaním s kalibračnou krivkou tvorenou poskytnutými kalibrátormi, koncentrácia
Potom sa vypočíta neutralizačné protilátky v neznámej vzorke.
【Požadované materiály, ale nie sú poskytnuté】
1. Destilovaná alebo deionizovaná voda
2. Presné pipety: 10 ul, 100 ul, 200 ul a 1 ml
3. Tipy na jednorazové pipety
4. Čítač mikroplatík schopná zčítať absorbanciu pri 450 nm.
5. Absorpčný papier
6. Grafový papier
7. Vortexový mixér alebo ekvivalent
【Zbierka a úložisko vzoriek】
1. Vzorky séra a plazmy odobraté v skúmavkách obsahujúcich K2-EDTA sa môžu použiť na túto súpravu.
2. Vzorky by sa mali pred testovaním uchovávať a môžu sa skladovať až 48 hodín pri 2 ° C - 8 ° C.
Vzorky držané dlhšie (až 6 mesiacov) by mali byť pred testom zmrazené iba raz pri -20 ° C.
Vyhnite sa opakovaným cyklom zmrazenia a rozmrazenia.
Protokol
【Príprava činidla】
1. Všetky činidlá musia byť vyradené z chladenia a pred použitím sa nechajú vrátiť k teplote miestnosti
(20 ° až 25 ° C). Po použití okamžite uložte všetky reagenty v chladničke.
2. Všetky vzorky a ovládacie prvky by sa mali pred použitím vortexovať.
3. Príprava roztoku HACE2-HRP: Zriedený koncentrát HACE2-HRP pri pomere riedenia 1: 51 s riedením
Vyrovnávacia pamäť. Napríklad zriedi 100 ul koncentrátu HACE2-HRP s 5,0 ml zriedkavého pufra HRP do
Vytvorte roztok HACE2-HRP.
4. 1 x prípravok pre premytie roztoku: zriedite 20x premytý roztok deionizovanou alebo destilovanou vodou
Pomer objemu 1:19. Napríklad zriedite 20 ml 20x premytného roztoku 380 ml deionizovaných alebo
Destilovaná voda na výrobu 400 ml roztoku 1 x premývacieho roztoku.
【Skúšobný postup】
1. V samostatných skúmavkách je alikvotné 120 ul pripraveného roztoku HACE2-HRP.
2. Pridajte 6 μl kalibrátorov, neznáme vzorky, kontroly kvality v každej skúmavke a dobre premiešajte.
3. Preneste 100 ul každej zmesi pripravenej v kroku 2 do zodpovedajúcich jamiek mikroplatov podľa
do vopred konfigurácie testu.
3. Zakryte dosku tesnením doštičky a inkubujte pri 37 ° C počas 30 minút.
4. Odstráňte doštičku a doštičku umyte približne 300 ul 1 x premytia roztoku na štyrikrát.
5. Po umytí schodov klepnite na tanier na papierovom utierke, aby ste po umytí schodov odstránili zvyškovú tekutinu v jamkách.
6. Pridajte do každej jamky 100 μl roztoku TMB a inkubujte doštičku v tme pri 20 - 25 ° C počas 20 minút.
7. Pridajte do každej jamky do každej jamky 50 ul zastavovacieho roztoku, aby ste zastavili reakciu.
8. Prečítajte si absorbanciu v čítačke mikroplatí
Odporúča sa pre vyššiu presnú výkonnosť).