SARS-CoV-2 උදාසීන ප්රතිදේහ හඳුනාගැනීමේ කට්ටලය (ELISA)
【මූලධර්මය】
SARS-CoV-2 උදාසීන ප්රතිදේහ හඳුනාගැනීමේ කට්ටලය තරඟකාරී ELISA ක්‍රමවේදය මත පදනම් වේ.
පිරිසිදු ප්‍රතිග්‍රාහක බන්ධන වසම (RBD), වෛරස් ස්පයික් (S) ප්‍රෝටීන් ප්‍රෝටීන් සහ ධාරක සෛලය භාවිතා කිරීම
ප්‍රතිග්‍රාහක ACE2, මෙම පරීක්ෂණය නිර්මාණය කර ඇත්තේ වෛරස්-ධාරක උදාසීන අන්තර්ක්‍රියාව අනුකරණය කිරීමට ය.
ක්‍රමාංකන, තත්ත්ව පාලන, සහ සෙරුමය හෝ ප්ලාස්මා සාම්පල තනි තනිව තනුක කර හොඳින් මිශ්‍ර කර ඇත.
hACE2-HRP conjugate අඩංගු බෆරය කුඩා ටියුබ්වල ඇලිකෝට් කර ඇත. එවිට මිශ්රණ මාරු කරනු ලැබේ
නිශ්චල ප්‍රතිසංයෝජක SARS-CoV-2 RBD කොටස (RBD) අඩංගු ක්ෂුද්‍ර තහඩු ළිං
ඉන්කියුබේෂන්. මිනිත්තු 30 ක ඉන්කියුබේෂන් අතරතුර, ක්‍රමාංකන යන්ත්‍රවල RBD විශේෂිත ප්රතිදේහ, QC සහ
ළිංවල නිශ්චල කර ඇති RBD නිශ්චිත බන්ධනය සඳහා සාම්පල hACE2-HRP සමඟ තරඟ කරනු ඇත. පසු
ඉන්කියුබේෂන්, නොබැඳි hACE2-HRP conjugate ඉවත් කිරීම සඳහා ළිං 4 වරක් සෝදා ඇත. විසඳුමක්
එවිට TMB එකතු කර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 20 ක් පුර්ව කථනය කරන අතර එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස a
නිල් වර්ණය. 1N HCl එකතු කිරීමත් සමඟ වර්ණ සංවර්ධනය නතර වන අතර අවශෝෂණය වේ
450 nm හි වර්ණාවලීක්ෂ ඡායාරූපමිතිකව මනිනු ලැබේ. සාදන ලද වර්ණයෙහි තීව්රතාවය සමානුපාතික වේ
පවතින එන්සයිම ප්‍රමාණය, සහ ඒ ආකාරයෙන්ම තක්සේරු කරන ලද ප්‍රමිති ප්‍රමාණයට ප්‍රතිලෝමව සම්බන්ධ වේ.
සපයා ඇති ක්‍රමාංකන මගින් සාදන ලද ක්‍රමාංකන වක්‍රය සමඟ සැසඳීම හරහා, සාන්ද්‍රණය
පසුව නොදන්නා නියැදියේ උදාසීන ප්රතිදේහ ගණනය කරනු ලැබේ.
【ද්‍රව්‍ය අවශ්‍ය නමුත් සපයා නැත】
1. ආසවනය කළ හෝ ඩීයෝනීකරණය කළ ජලය
2. නිරවද්‍ය පයිප්ප: 10μL, 100μL,200μL සහ 1 mL
3. ඉවත දැමිය හැකි පයිප්ප ඉඟි
4. 450nm දී අවශෝෂණය කියවීමේ හැකියාව ඇති මයික්‍රොප්ලේට් කියවනය.
5. අවශෝෂක කඩදාසි
6. ප්රස්තාර පත්රය
7. Vortex mixer හෝ ඊට සමාන
【නිදර්ශක එකතු කිරීම සහ ගබඩා කිරීම】
1. මෙම කට්ටලය සඳහා K2-EDTA අඩංගු නලවල එකතු කරන ලද සෙරුමය සහ ප්ලාස්මා සාම්පල භාවිතා කළ හැක.
2. නිදර්ශක ආවරණය කළ යුතු අතර, විශ්ලේෂණයට පෙර 2 °C - 8 °C උෂ්ණත්වයකදී පැය 48ක් දක්වා ගබඩා කළ හැක.
දිගු කාලයක් (මාස 6 ක් දක්වා) රඳවා තබා ඇති නිදර්ශක විශ්ලේෂණයට පෙර -20 ° C දී එක් වරක් පමණක් ශීත කළ යුතුය.
නැවත නැවත කැටි- දියවන චක්‍රවලින් වළකින්න.
ප්රොටෝකෝලය
【ප්රතික්රියාකාරක සකස් කිරීම】
1. සියලුම ප්රතික්රියාකාරක ශීතකරණයෙන් පිටතට ගෙන භාවිතයට පෙර කාමර උෂ්ණත්වයට නැවත පැමිණීමට ඉඩ දිය යුතුය
(20° සිට 25°C දක්වා). සියලුම ප්රතික්රියාකාරක භාවිතා කිරීමෙන් පසු ඉක්මනින් ශීතකරණයේ සුරකින්න.
2. සියලුම සාම්පල සහ පාලන භාවිතයට පෙර සුළි කළ යුතුය.
3. hACE2-HRP විසඳුම සකස් කිරීම: hACE2-HRP සාන්ද්‍රණය 1: 51 තනුක අනුපාතය තනුක සමග තනුක කරන්න
බෆරය. උදාහරණයක් ලෙස, hACE2-HRP සාන්ද්‍රණය 100 μL HRP Dilution Buffer 5.0mL සමඟ තනුක කරන්න.
hACE2-HRP විසඳුමක් සාදන්න.
4. 1× වොෂ් විසඳුම සකස් කිරීම: 20× වොෂ් ද්‍රාවණය ඩියෝනීකරණය කළ හෝ ආස්රැත ජලය සමග තනුක කරන්න.
පරිමාව අනුපාතය 1:19. උදාහරණයක් ලෙස, 20 × වොෂ් ද්‍රාවණයෙන් මිලි ලීටර් 20 ක් ඩියෝනීකරණය කළ හෝ මිලි ලීටර් 380 ක් සමඟ තනුක කරන්න
1× වොෂ් ද්‍රාවණයෙන් මිලි ලීටර් 400ක් සෑදීමට ආසවනය කළ ජලය.
【පරීක්ෂණ ක්රියා පටිපාටිය】
1. වෙනම නල වල, සකස් කළ hACE2-HRP විසඳුමේ aliquot 120μL.
2. එක් එක් නලයට ක්‍රමාංකන යන්ත්‍ර 6 μL, නොදන්නා සාම්පල, තත්ත්ව පාලන එකතු කර හොඳින් මිශ්‍ර කරන්න.
3. පියවර 2 හි සකස් කරන ලද එක් එක් මිශ්‍රණයෙන් 100μL අනුරූප මයික්‍රොප්ලේට් ළිංවලට මාරු කරන්න.
පූර්ව සැලසුම් කළ පරීක්ෂණ වින්‍යාසයට.
3. ප්ලේට් සීලර් සමඟ තහඩුව ආවරණය කර විනාඩි 30 ක් සඳහා 37 ° C උෂ්ණත්වයකදී ඉන්කියුබේට් කරන්න.
4. ප්ලේට් සීලර් ඉවත් කර ළිඳකට දළ වශයෙන් 300 μL 1× වොෂ් ද්‍රාවණයකින් පිඟාන හතර වතාවක් සෝදන්න.
5. සේදීමේ පියවරෙන් පසු ළිංවල අවශේෂ දියර ඉවත් කිරීමට කඩදාසි තුවා මත තහඩුව තට්ටු කරන්න.
6. සෑම ළිඳකටම TMB ද්‍රාවණය 100 μL එකතු කර විනාඩි 20ක් සඳහා තහඩුව 20 - 25°C අඳුරේ පුර්වාගත කරන්න.
7. ප්‍රතික්‍රියාව නැවැත්වීම සඳහා එක් එක් ළිඳට Stop Solution 50 μL එක් කරන්න.
8. මිනිත්තු 10ක් ඇතුළත මයික්‍රොප්ලේට් රීඩරයේ 450 nm හි අවශෝෂණය කියවන්න (ආයිත්තමක් ලෙස 630nm
ඉහළ නිරවද්‍ය කාර්ය සාධනය සඳහා නිර්දේශ කෙරේ).