SARS-CoV-2 غير جانبدار اينٽي باڊي ڊيٽيڪشن ڪٽ (ELISA)
【اصول】
SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit مقابلي واري ELISA طريقي تي ٻڌل آهي.
استعمال ڪندي صاف ڪندڙ ريڪٽر بائنڊنگ ڊومين (RBD)، پروٽين مان وائرل اسپائڪ (S) پروٽين ۽ ميزبان سيل
ريڪارڊر ACE2، هي ٽيسٽ وائرس ميزبان کي غير جانبدار ڪرڻ واري رابطي کي نقل ڪرڻ لاءِ ٺهيل آهي.
ڪليبريٽر، ڪوالٽي ڪنٽرول، ۽ سيرم يا پلازما جا نمونا انفرادي طور تي چڱيءَ طرح ملايا ويندا آهن.
بفر جنهن ۾ hACE2-HRP ڪنجوگيٽ aliquoted ننڍي ٽيوب ۾.ان کان پوء مرکب کي منتقل ڪيو ويو آهي
مائڪرو پليٽ کوهه جنهن ۾ غير متحرڪ ريٽومبيننٽ SARS-CoV-2 RBD فريگمينٽ (RBD) لاءِ
انڪيوبيشن.30 منٽن جي انڪيوبيشن دوران، آر بي ڊي مخصوص اينٽي باڊي ڪليبريٽر ۾، QC ۽
نمونا hACE2-HRP سان مقابلو ڪندا مخصوص بائنڊنگ لاءِ آر بي ڊي کي کوهن ۾ متحرڪ.کان پوء
انڪيوبيشن ۾، کوهه 4 ڀيرا ڌويا ويندا آهن ته جيئن اڻڄاتل hACE2-HRP ڪنجوگيٽ کي هٽايو وڃي.جو هڪ حل
TMB پوءِ شامل ڪيو ويندو آهي ۽ ڪمري جي حرارت تي 20 منٽن لاءِ انڪيوبيو ويندو آهي، جنهن جي نتيجي ۾ a
نيرو رنگ.1N HCl جي اضافي سان رنگ جي ترقي کي روڪيو ويو آهي، ۽ جذب آهي
450 nm تي spectrophotometrically ماپي وئي.ٺهيل رنگ جي شدت جي تناسب سان آهي
اينزيم جي مقدار موجود آهي، ۽ ساڳئي طريقي سان مقرر ڪيل معيار جي مقدار سان لاڳاپيل آهي.
مهيا ڪيل ڪيليبريٽرز پاران ٺاهيل ڪيليبريشن وکر سان مقابلي جي ذريعي، ڪنسنٽريشن
اڻڄاتل نموني ۾ اينٽي باڊيز کي غير جانبدار ڪرڻ جو حساب ڪيو ويندو آهي.
【مواد گھربل آھي پر مهيا نه ڪيو ويو】
1. ڊسٽل ٿيل يا ديونائيزڊ پاڻي
2. پريسيسن پائپيٽ: 10μL، 100μL، 200μL ۽ 1 mL
3. ڊسپوزيبل پائيپٽ ٽائيپ
4. Microplate پڙهندڙ 450nm تي جذب پڙهڻ جي قابل.
5. جاذب ڪاغذ
6. گراف پيپر
7. Vortex mixer يا برابر
【نموني گڏ ڪرڻ ۽ اسٽوريج】
1. K2-EDTA تي مشتمل ٽيوب ۾ گڏ ڪيل سيرم ۽ پلازما جا نمونا هن کٽ لاءِ استعمال ڪري سگهجن ٿا.
2. نمونن کي بند ڪيو وڃي ۽ 2 ° C - 8 ° C تي 48 ڪلاڪن تائين ذخيرو ڪرڻ کان اڳ محفوظ ڪيو وڃي.
گهڻي وقت تائين رکيل نمونن (6 مهينن تائين) صرف هڪ ڀيرو -20 ° C تي پرکھ کان اڳ منجمد ٿيڻ گهرجي.
بار بار منجمد ٿيڻ واري چڪر کان پاسو ڪريو.
پروٽوڪول
【ريجنٽ تيار ڪرڻ】
1. استعمال ڪرڻ کان اڳ سڀني ريجنٽس کي ريفريجريشن مان ڪڍيو وڃي ۽ ڪمري جي حرارت تي موٽڻ جي اجازت ڏني وڃي
(20 ° کان 25 ° سي).استعمال ڪرڻ کان پوء فوري طور تي ريفريجريٽر ۾ سڀئي ريجنٽ محفوظ ڪريو.
2. سڀ نموني ۽ ڪنٽرول استعمال ڪرڻ کان اڳ vortexed ڪيو وڃي.
3. hACE2-HRP حل تيار ڪرڻ: dilution سان 1:51 dilution ratio تي hACE2-HRP ڪنسنٽريٽ کي گھٽايو
بفر.مثال طور، 100 μL hACE2-HRP ڪنسنٽريٽ کي 5.0mL HRP Dilution Buffer سان ملايو.
هڪ hACE2-HRP حل ٺاهيو.
4. 1× ڌوئي حل تيار ڪرڻ: 20× ڌوئي حل کي ڊيونائيزڊ يا ڊسٽل واٽر سان ملايو
حجم جو تناسب 1:19.مثال طور، 20 ايم ايل جي 20 × واش حل کي 380 ايم ايل ڊي آئنائيزڊ سان ٺهڪيو
400 ايم ايل 1× واش حل ڪرڻ لاءِ ڊسٽل پاڻي.
【ٽيسٽ جو طريقو】
1. الڳ ٽيوب ۾، تيار ڪيل hACE2-HRP حل جو 120μL aliquot.
2. هر ٽيوب ۾ 6 μL calibrators، اڻڄاتل نمونا، ڪيفيت ڪنٽرول شامل ڪريو ۽ چڱي طرح ملايو.
3. مرحلا 2 ۾ تيار ڪيل هر مرکب جو 100μL مطابق لاڳاپيل مائڪرو پليٽ ويلز ۾ منتقل ڪريو
اڳواٽ ترتيب ڏنل ٽيسٽ ترتيب ڏيڻ لاءِ.
3. پليٽ سيلر سان پليٽ کي ڍڪيو ۽ 37 ° C تي 30 منٽن لاء سينگيو.
4. پليٽ سيلر کي هٽايو ۽ پليٽ کي 300 μL جي 1× ڌوئي حل في چڱيءَ سان چار دفعا ڌويو.
5. پليٽ کي ڪاغذ جي تولي تي ٽيپ ڪريو ته جيئن کوهن ۾ موجود رهجي ويل مائع کي ڌوئڻ کان پوءِ.
6. هر کوهه ۾ 100 μL TMB محلول شامل ڪريو ۽ پليٽ کي اونداهي ۾ 20 - 25 ° C تي 20 منٽن لاءِ سينگاريو.
7. رد عمل کي روڪڻ لاءِ هر کوهه ۾ 50 μL اسٽاپ حل شامل ڪريو.
8. مائڪروپليٽ ريڊر ۾ 450 nm تي 10 منٽن جي اندر جاذب کي پڙهو (630nm جيئن رسائي آهي
اعلي صحت واري ڪارڪردگي لاء سفارش ڪئي وئي).
