Набор для обнаружения нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 (ИФА)
【ПРИНЦИП】
Набор для обнаружения нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 основан на конкурентной методике ИФА.
Использование очищенного рецептор-связывающего домена (RBD), белка вирусного шипа (S) и клетки-хозяина.
рецептора ACE2, этот тест предназначен для имитации нейтрализующего взаимодействия вирус-хозяин.
Калибраторы, средства контроля качества и образцы сыворотки или плазмы тщательно перемешиваются в разведении по отдельности.
буфер, содержащий конъюгат hACE2-HRP, разлитый в небольшие пробирки.Затем смеси переносят в
лунки микропланшета, содержащие иммобилизованный рекомбинантный фрагмент RBD SARS-CoV-2 (RBD) для
инкубация.В течение 30-минутной инкубации специфическое антитело RBD в калибраторах, контрольном тесте и
образцы будут конкурировать с hACE2-HRP за специфическое связывание с RBD, иммобилизованным в лунках.После
После инкубации лунки промывают 4 раза для удаления несвязавшегося конъюгата hACE2-HRP.Решение
Затем добавляют ТМВ и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре, что приводит к развитию
Синий цвет.Развитие окраски останавливают добавлением 1 н. HCl, и оптическая плотность снижается.
измерено спектрофотометрически при 450 нм.Интенсивность образующегося цвета пропорциональна
количество присутствующего фермента обратно пропорционально количеству стандартов, анализируемых таким же образом.
Путем сравнения с калибровочной кривой, полученной с помощью предоставленных калибраторов, концентрация
Затем рассчитывают нейтрализующие антитела в неизвестном образце.
【НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПРЕДОСТАВЛЯЕМЫЕ МАТЕРИАЛЫ】
1. Дистиллированная или деионизированная вода.
2. Прецизионные пипетки: 10 мкл, 100 мкл, 200 мкл и 1 мл.
3. Одноразовые наконечники для пипеток.
4. Считыватель микропланшетов, способный измерять поглощение при длине волны 450 нм.
5. Впитывающая бумага
6. Миллиметровая бумага
7. Вихревой смеситель или аналогичный.
【СБОР И ХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ】
1. Для этого набора можно использовать образцы сыворотки и плазмы, собранные в пробирки, содержащие K2-EDTA.
2. Образцы должны быть закрыты крышками и могут храниться до 48 часов при температуре 2–8 °C перед анализом.
Образцы, хранившиеся в течение длительного времени (до 6 месяцев), следует заморозить только один раз при температуре -20 °C перед анализом.
Избегайте повторяющихся циклов замораживания-оттаивания.
ПРОТОКОЛ
【Подготовка реагентов】
1. Все реагенты необходимо вынуть из холодильника и дать им вернуться к комнатной температуре перед использованием.
(от 20° до 25°С).Сразу после использования храните все реагенты в холодильнике.
2. Все образцы и контроли перед использованием следует перемешать на вортексе.
3. Приготовление раствора hACE2-HRP: разбавьте концентрат hACE2-HRP в соотношении разбавления 1: 51 с помощью разбавления.
Буфер.Например, разбавьте 100 мкл концентрата hACE2-HRP 5,0 мл буфера для разведения HRP до
приготовить раствор hACE2-HRP.
4. Приготовление 1× промывочного раствора: разбавьте 20× промывной раствор деионизированной или дистиллированной водой с добавлением
соотношение объемов 1:19.Например, разбавьте 20 мл 20× промывочного раствора 380 мл деионизированного или
дистиллированной воды для приготовления 400 мл 1× промывочного раствора.
【Тестовая процедура】
1. В отдельные пробирки разлейте аликвоты по 120 мкл приготовленного раствора hACE2-HRP.
2. Добавьте в каждую пробирку по 6 мкл калибраторов, неизвестных образцов, контролей качества и хорошо перемешайте.
3. Перенесите по 100 мкл каждой смеси, приготовленной на шаге 2, в соответствующие лунки микропланшета в соответствии с
к заранее разработанной тестовой конфигурации.
3. Накройте планшет Plate Sealer и инкубируйте при 37°C в течение 30 минут.
4. Снимите герметик планшета и промойте планшет примерно 300 мкл 1× промывочного раствора на лунку четыре раза.
5. Постучите планшетом по бумажному полотенцу, чтобы удалить остатки жидкости в лунках после промывания.
6. Добавьте по 100 мкл раствора ТМБ в каждую лунку и инкубируйте планшет в темноте при температуре 20–25°C в течение 20 минут.
7. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл стоп-раствора, чтобы остановить реакцию.
8. Считайте поглощение в микропланшетном ридере при 450 нм в течение 10 минут (630 нм в качестве аксессуара).
рекомендуется для более высокой точности).
