Kit de detectare a anticorpilor neutralizanți SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINCIPIU】
Kitul de detectare a anticorpilor neutralizanți SARS-CoV-2 se bazează pe metodologia ELISA competitivă.
Folosind domeniul de legare a receptorului purificat (RBD), proteina din proteina spike virală (S) și celula gazdă
receptor ACE2, acest test este conceput pentru a imita interacțiunea de neutralizare virus-gazdă.
Calibratoarele, controalele de calitate și probele de ser sau plasmă sunt bine amestecate individual în diluție
tampon care conține conjugatul hACE2-HRP alicotat în tuburi mici.Apoi amestecurile sunt transferate
godeurile microplăcilor care conțin fragment RBD SARS-CoV-2 recombinant imobilizat (RBD) pentru
incubatie.În timpul incubației de 30 de minute, anticorpul specific RBD din calibratori, QC și
probele vor concura cu hACE2-HRP pentru legarea specifică a RBD imobilizat în godeuri.După
la incubare, godeurile sunt spălate de 4 ori pentru a îndepărta conjugatul hACE2-HRP nelegat.O solutie de
TMB este apoi adăugat și incubat timp de 20 de minute la temperatura camerei, rezultând în dezvoltarea a
culoarea albastra.Dezvoltarea culorii este oprită prin adăugarea de HCI 1N, iar absorbanța este
măsurată spectrofotometric la 450 nm.Intensitatea culorii formate este proporțională cu
cantitatea de enzimă prezentă și este invers legată de cantitatea de standarde testate în același mod.
Prin compararea cu curba de calibrare formată de calibratoarele furnizate, concentrația de
apoi se calculează anticorpii neutralizanți din proba necunoscută.
【MATERIALE NECESARE, DAR NU FURZE】
1. Apă distilată sau deionizată
2. Pipete de precizie: 10μL, 100μL, 200μL și 1 ml
3. Vârfuri de pipetă de unică folosință
4. Cititor de microplaci capabil sa citeasca absorbanta la 450nm.
5. Hârtie absorbantă
6. Hârtie milimetrică
7. Mixer vortex sau echivalent
【COLECTAREA ŞI DEPOZITAREA PROBELOR】
1. Probele de ser și plasmă colectate în tuburi care conțin K2-EDTA pot fi utilizate pentru acest kit.
2. Probele trebuie acoperite cu capac și pot fi păstrate până la 48 de ore la 2 °C - 8 °C înainte de testare.
Probele păstrate mai mult timp (până la 6 luni) trebuie congelate o singură dată la -20 °C înainte de analiză.
Evitați ciclurile repetate de îngheț-dezgheț.
PROTOCOL
【Prepararea reactivului】
1. Toți reactivii trebuie scoși din frigider și lăsați să revină la temperatura camerei înainte de utilizare
(20° până la 25°C).Păstrați toți reactivii în frigider imediat după utilizare.
2. Toate probele și controalele trebuie agitate înainte de utilizare.
3. Prepararea soluției hACE2-HRP: Se diluează concentratul hACE2-HRP la un raport de diluție de 1: 51 cu Diluție
Tampon.De exemplu, diluați 100 μL de concentrat hACE2-HRP cu 5,0 ml de tampon de diluție HRP la
faceți o soluție hACE2-HRP.
4. Prepararea soluției de spălare 1×: Se diluează soluția de spălare 20× cu apă deionizată sau distilată cu un
raport de volum de 1:19.De exemplu, diluați 20 ml de soluție de spălare 20x cu 380 ml de soluție deionizată sau
apă distilată pentru a obține 400 ml de soluție de spălare 1×.
【Procedura de testare】
1. În tuburi separate, alicotați 120μL din soluția hACE2-HRP preparată.
2. Adăugați 6 μL de calibratori, probe necunoscute, controale de calitate în fiecare tub și amestecați bine.
3. Transferați 100μL din fiecare amestec preparat în pasul 2 în godeurile corespunzătoare pentru microplăci, conform
la configurația de test prestabilită.
3. Acoperiți placa cu Plate Sealer și incubați la 37°C timp de 30 de minute.
4. Îndepărtați placa de etanșare și spălați placa cu aproximativ 300 μL de soluție de spălare 1× per godeu de patru ori.
5. Atingeți placa pe un prosop de hârtie pentru a îndepărta lichidul rezidual din godeuri după etapele de spălare.
6. Adăugați 100 μL de soluție TMB în fiecare godeu și incubați placa la întuneric la 20 - 25°C timp de 20 de minute.
7. Adăugați 50 μL de soluție de oprire în fiecare godeu pentru a opri reacția.
8. Citiți absorbanța în cititorul de microplăci la 450 nm în 10 minute (630 nm ca accesoriu este
recomandat pentru performanțe de precizie mai mare).
