Kit de detectare a anticorpului SARS-CoV-2 neutralizant (ELISA)
【PRINCIPIU】
Kitul de detectare a anticorpilor de neutralizare SARS-CoV-2 se bazează pe metodologia competitivă ELISA.
Utilizarea domeniului de legare a receptorului purificat (RBD), proteine din proteina virală (S) și celula gazdă
Receptor ACE2, acest test este conceput pentru a imita interacțiunea de neutralizare a virusului-gazdă.
Calibratoarele, controalele de calitate și probele de ser sau plasmă sunt amestecate individual în diluție
Buffer care conține conjugat HACE2-HRP alicotat în tuburi mici. Atunci amestecurile sunt transferate în
Sondele de microplate care conțin fragment RBD RBD recombinant imobilizat (RBD) pentru
incubație. În timpul incubării de 30 de minute, anticorpul specific RBD în calibratoare, QC și
Probele vor concura cu HACE2-HRP pentru legarea specifică RBD imobilizată în puțuri. După
Incubarea, puțurile sunt spălate de 4 ori pentru a îndepărta conjugatul HACE2-HRP nelimitat. O soluție de
TMB este apoi adăugat și incubat timp de 20 de minute la temperatura camerei, ceea ce duce la dezvoltarea unui
Culoare albastră. Dezvoltarea culorilor este oprită cu adăugarea de 1N HCl, iar absorbția este
măsurată spectrofotometric la 450 nm. Intensitatea culorii formate este proporțională cu
Cantitatea de enzimă prezentă și este invers legată de valoarea standardelor testate în același mod.
Prin comparație cu curba de calibrare formată de calibratoarele furnizate, concentrația de
Se calculează neutralizarea anticorpilor din eșantionul necunoscut.
【Materiale necesare, dar nu sunt furnizate】
1. apă distilată sau deionizată
2..
3. Sfaturi de pipetă de unică folosință
4. Cititor de microplate capabil să citească absorbția la 450 nm.
5. Hârtie absorbantă
6. Hârtie grafică
7. Mixer vortex sau echivalent
【Colectarea și stocarea eșantioanelor】
1.. Probele de ser și plasmă colectate în tuburi care conțin K2-EDTA pot fi utilizate pentru acest kit.
2. Exemplarele trebuie acoperite și pot fi păstrate până la 48 de ore la 2 ° C - 8 ° C înainte de testare.
Exemplarele deținute pentru o perioadă mai lungă (până la 6 luni) ar trebui să fie înghețate o singură dată la -20 ° C înainte de testare.
Evitați ciclurile repetate de îngheț.
PROTOCOL
【Pregătirea reactivului】
1. Toți reactivii trebuie scoși din frigider și lăsate să se întoarcă la temperatura camerei înainte de utilizare
(20 ° până la 25 ° C). Salvați toți reactivii în frigider prompt după utilizare.
2. Toate eșantioanele și controalele ar trebui să fie vortexate înainte de utilizare.
3. Prepararea soluției HACE2-HRP: concentrat diluat HACE2-HRP la un raport de diluare 1: 51 cu diluție
Tampon. De exemplu, diluați 100 µl de concentrat de HACE2-HRP cu 5,0 ml de tampon de diluare HRP până la
Faceți o soluție HACE2-HRP.
4. 1 × Pregătirea soluției de spălare: Diluați soluția de spălare 20 × cu apă deionizată sau distilată cu un
raport de volum de 1:19. De exemplu, diluează 20 ml soluție de spălare 20 × cu 380 ml de deionizat sau
Apă distilată pentru a face 400 ml soluție de spălare 1 ×.
【Procedura de testare】
1. În tuburi separate, alicotă 120 µl din soluția HACE2-HRP preparată.
2. Adăugați 6 µl de calibratoare, probe necunoscute, controale de calitate în fiecare tub și amestecați bine.
3. Transfer 100 µl din fiecare amestec preparat în etapa 2 în puțuri de microplate corespunzătoare în funcție de
la configurația testului predesemnat.
3. Acoperiți placa cu etanșarea plăcii și incubați la 37 ° C timp de 30 de minute.
4. Scoateți etanșarea plăcii și spălați placa cu aproximativ 300 µl de soluție de spălare 1 × pentru patru ori.
5. Atingeți farfuria de pe prosopul de hârtie pentru a îndepărta lichidul rezidual în puțuri după pașii de spălare.
6. Adăugați 100 µl de soluție TMB la fiecare godeu și incubați placa în întuneric la 20 - 25 ° C timp de 20 de minute.
7. Adăugați 50 µl de soluție de oprire la fiecare godeu pentru a opri reacția.
8. Citiți absorbția în cititorul de microplați la 450 nm în 10 minute (630 nm ca accesoriu
Recomandat pentru o performanță de precizie mai mare).