Kit de detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINCÍPIO】
O kit de detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 é baseado na metodologia ELISA competitiva.
Usando o domínio de ligação ao receptor purificado (RBD), proteína da proteína (s) de pico viral e a célula hospedeira
Receptor ACE2, este teste foi projetado para imitar a interação neutralização do vírus hospedeiro.
Calibradores, controles de qualidade e amostras de soro ou plasma são bem misturadas individualmente em diluição
Buffer contendo o conjugado HACE2-HRP aliquitado em pequenos tubos. Então as misturas são transferidas em
Os poços de microplacas contendo um fragmento imobilizado recombinante SARS-Cov-2 RBD (RBD) para
incubação. Durante a incubação de 30 minutos, o anticorpo específico da RBD nos calibradores, QC e
As amostras competirão com o HACE2-HRP por ligação específica do RBD imobilizado nos poços. Depois
A incubação, os poços são lavados 4 vezes para remover o conjugado não ligado HACE2-HRP. Uma solução de
O TMB é então adicionado e incubado por 20 minutos à temperatura ambiente, resultando no desenvolvimento de um
cor azul. O desenvolvimento de cores é interrompido com a adição de 1n HCl, e a absorvância é
medido espectrofotometricamente a 450 nm. A intensidade da cor formada é proporcional ao
A quantidade de enzima presente e está inversamente relacionada à quantidade de padrões analisados da mesma maneira.
Através da comparação com a curva de calibração formada pelos calibradores fornecidos, a concentração de
Os anticorpos neutralizantes na amostra desconhecida são calculados.
【Materiais necessários, mas não fornecidos】
1. Água destilada ou desionizada
2. Pipetas de precisão: 10μl, 100μl, 200μl e 1 ml
3. Dicas de pipeta descartáveis
4. Leitor de microplacas capaz de ler a absorvância a 450Nm.
5. papel absorvente
6. Papel de gráfico
7. Mixer de vórtice ou equivalente
【Coleta e armazenamento de amostras】
1. Amostras de soro e plasma coletadas em tubos contendo K2-EDTA podem ser usadas para este kit.
2. As amostras devem ser limitadas e podem ser armazenadas por até 48 horas a 2 ° C - 8 ° C antes do teste.
As amostras mantidas por mais tempo (até 6 meses) devem ser congeladas apenas uma vez a -20 ° C antes do ensaio.
Evite ciclos repetidos de congelamento e desconfiança.
PROTOCOLO
【Preparação do reagente】
1. Todos os reagentes devem ser retirados da refrigeração e permitidos retornar à temperatura ambiente antes de usar
(20 ° a 25 ° C). Salve todos os reagentes na geladeira imediatamente após o uso.
2. Todas as amostras e controles devem ser agitados antes do uso.
3. Preparação da solução HACE2-HRP: Dilute HACE2-HRP Concentrado na taxa de diluição 1: 51 com diluição
Buffer. Por exemplo, diluir 100 μl de concentrado de HACE2-HRP com 5,0 ml de tampão de diluição de HRP para
Faça uma solução HACE2-HRP.
4. Preparação da solução de lavagem 1 ×: diluir a solução de lavagem 20 × com água desionizada ou destilada com um
razão de volume de 1:19. Por exemplo, diluir 20 ml de solução de 20 × lavagem com 380 ml de desionizada ou
Água destilada para fabricar 400 ml de solução de lavagem 1 ×.
【Procedimento de teste】
1. Em tubos separados, alíquotas 120μL da solução preparada de HACE2-HRP.
2. Adicione 6 μl de calibradores, amostras desconhecidas, controles de qualidade em cada tubo e misture bem.
3. Transferir 100μl de cada mistura preparada na Etapa 2 para os poços de microplacas correspondentes de acordo
para a configuração de teste pré -designada.
3. Cubra a placa com selador de placa e incubar a 37 ° C por 30 minutos.
4. Remova o selador da placa e lave a placa com aproximadamente 300 μl de solução de lavagem 1 × por poço por quatro vezes.
5. Toque na placa na toalha de papel para remover o líquido residual nos poços após as etapas de lavagem.
6. Adicione 100 μl de solução TMB a cada poço e incube a placa no escuro a 20 a 25 ° C por 20 minutos.
7. Adicione 50 μl de solução de parada a cada poço para interromper a reação.
8. Leia a absorvância no leitor de microplacas a 450 nm em 10 minutos (630 nm como o acessório é
recomendado para maior desempenho de precisão).