Kit de detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINCÍPIO】
O kit de detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 é baseado na metodologia ELISA competitiva.
Usando domínio de ligação ao receptor purificado (RBD), proteína da proteína do pico viral (S) e da célula hospedeira
receptor ACE2, este teste foi projetado para imitar a interação neutralizante vírus-hospedeiro.
Calibradores, controles de qualidade e amostras de soro ou plasma são bem misturados individualmente em diluição
tampão contendo conjugado hACE2-HRP dividido em alíquotas em pequenos tubos.Em seguida, as misturas são transferidas
os poços da microplaca contendo fragmento RBD SARS-CoV-2 recombinante imobilizado (RBD) para
incubação.Durante a incubação de 30 minutos, o anticorpo específico RBD nos calibradores, CQ e
as amostras competirão com o hACE2-HRP pela ligação específica do RBD imobilizado nos poços.Depois
Após a incubação, os poços são lavados 4 vezes para remover o conjugado hACE2-HRP não ligado.Uma solução de
O TMB é então adicionado e incubado por 20 minutos em temperatura ambiente, resultando no desenvolvimento de um
cor azul.O desenvolvimento da cor é interrompido com a adição de HCl 1N e a absorbância é
medido espectrofotometricamente a 450 nm.A intensidade da cor formada é proporcional à
quantidade de enzima presente e está inversamente relacionada à quantidade de padrões ensaiados da mesma forma.
Através da comparação com a curva de calibração formada pelos calibradores fornecidos, a concentração de
anticorpos neutralizantes na amostra desconhecida são então calculados.
【MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS】
1. Água destilada ou deionizada
2. Pipetas de precisão: 10μL, 100μL,200μL e 1 mL
3. Pontas de pipeta descartáveis
4. Leitor de microplacas capaz de ler a absorbância a 450nm.
5. Papel absorvente
6. Papel milimetrado
7. Misturador Vortex ou equivalente
【COLETA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS】
1. Amostras de soro e plasma coletadas em tubos contendo K2-EDTA podem ser usadas neste kit.
2. As amostras devem ser tampadas e podem ser armazenadas por até 48 horas entre 2 °C e 8 °C antes do ensaio.
As amostras conservadas por um período mais longo (até 6 meses) devem ser congeladas apenas uma vez a -20 °C antes do ensaio.
Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
PROTOCOLO
【Preparação de Reagentes】
1. Todos os reagentes devem ser retirados da refrigeração e deixados retornar à temperatura ambiente antes do uso.
(20° a 25°C).Guarde todos os reagentes no frigorífico imediatamente após a utilização.
2. Todas as amostras e controles devem ser agitados em vórtex antes do uso.
3. Preparação da solução hACE2-HRP: Diluir o concentrado hACE2-HRP na proporção de diluição de 1: 51 com diluição
Amortecedor.Por exemplo, dilua 100 μL de concentrado hACE2-HRP com 5,0mL de tampão de diluição HRP para
faça uma solução hACE2-HRP.
4. Preparação da Solução de Lavagem 1×: Dilua a Solução de Lavagem 20× com água deionizada ou destilada com um
relação de volume de 1:19.Por exemplo, dilua 20 mL de solução de lavagem 20× com 380 mL de solução desionizada ou
água destilada para fazer 400 mL de solução de lavagem 1×.
【Procedimento de teste】
1. Em tubos separados, alíquota de 120 μL da solução hACE2-HRP preparada.
2. Adicione 6 μL de calibradores, amostras desconhecidas e controles de qualidade em cada tubo e misture bem.
3. Transfira 100μL de cada mistura preparada na etapa 2 para os poços da microplaca correspondentes de acordo com
para configuração de teste pré-projetada.
3. Cubra a placa com Plate Sealer e incube a 37°C durante 30 minutos.
4. Remova o selador de placa e lave a placa com aproximadamente 300 μL de solução de lavagem 1× por poço quatro vezes.
5. Bata a placa sobre papel toalha para remover o líquido residual dos poços após as etapas de lavagem.
6. Adicione 100 μL de solução TMB a cada poço e incube a placa no escuro a 20 - 25°C durante 20 minutos.
7. Adicione 50 μL de solução de parada a cada poço para interromper a reação.
8. Leia a absorbância no leitor de microplacas a 450 nm em 10 minutos (630 nm como acessório é fornecido).
recomendado para desempenho de maior precisão).
