SARS-CoV-2 بې طرفه کولو انټي باډي کشف کټ (ELISA)
【اصول】
د SARS-CoV-2 بې طرفه کولو انټي باډي کشف کټ د رقابتي ELISA میتودولوژي پراساس دی.
د پاک شوي ریسیپټر پابند ډومین (RBD) کارول ، د ویروس سپیک (S) پروټین او کوربه حجرې څخه پروټین
ریسیپټر ACE2، دا ازموینه د ویروس کوربه بې طرفه تعامل تقلید کولو لپاره ډیزاین شوې.
کیلیبریټرونه، د کیفیت کنټرولونه، او د سیرم یا پلازما نمونې په انفرادي ډول په ښه توګه مخلوط شوي دي
بفر چې د HACE2-HRP کنجوجیټ لري په وړو ټیوبونو کې aliquoted.بیا مخلوطونه لیږدول کیږي
د مایکروپلیټ څاه ګانې چې غیر متحرک ریکومبیننټ SARS-CoV-2 RBD ټوټه (RBD) لري
انکیوبیشند 30 دقیقو انکیوبیشن په جریان کې ، د RBD ځانګړی انټي باډي په کیلیبرټرونو کې ، QC او
نمونې به د HACE2-HRP سره سیالي وکړي ترڅو په څاه ګانو کې غیر متحرک RBD ځانګړي پابند کړي.وروسته
د انکیوبیشن په جریان کې، څاه 4 ځله مینځل کیږي ترڅو غیر محدود HACE2-HRP کنجیټ لرې کړي.د حل لاره
بیا TMB اضافه کیږي او د خونې په حرارت کې د 20 دقیقو لپاره مینځل کیږي، چې په پایله کې د a وده کوي
نیلي رنګد رنګ وده د 1N HCl اضافه کولو سره ودریږي ، او جذب یې دی
په 450 nm سپیکٹرو فوټومیټریک اندازه شوی.د جوړ شوي رنګ شدت د رنګ سره متناسب دی
د انزایم مقدار شتون لري او په ورته ډول د ټاکل شوي معیارونو مقدار سره په معکوس ډول تړاو لري.
د چمتو شوي کیلیبریټرونو لخوا رامینځته شوي کیلیبریشن منحني سره پرتله کولو له لارې ، د غلظت غلظت
په نامعلومه نمونه کې د انټي باډي بې طرفه کول بیا محاسبه کیږي.
【توکي اړین دي مګر چمتو شوي ندي】
1. منحل شوي یا deionized اوبه
2. دقیق پایپټ: 10μL، 100μL، 200μL او 1 mL
3. د ضایع کیدو وړ پایپټ لارښوونې
4. د مایکروپلیټ ریډر په 450nm کې د جاذبې لوستلو وړتیا لري.
5. جاذبه کاغذ
6. ګراف کاغذ
7. Vortex مکسر یا مساوي
【د نمونو راټولول او ذخیره کول】
1. د سیرم او پلازما نمونې په ټیوبونو کې راټول شوي چې K2-EDTA لري د دې کټ لپاره کارول کیدی شي.
2. نمونې باید بندې شي او تر 48 ساعتونو پورې په 2 ° C - 8 ° C کې د ارزونې دمخه زیرمه شي.
هغه نمونې چې د اوږدې مودې لپاره ساتل کیږي (تر 6 میاشتو پورې) باید د ارزونې دمخه یوازې یو ځل په -20 ° C کې کنګل شي.
د بار بار یخ وهلو دورې څخه مخنیوی وکړئ.
پروتوکول
【Reagent چمتووالی】
1. ټول ریجنټونه باید د یخچال څخه وایستل شي او د کارولو دمخه د خونې د حرارت درجه ته بیرته راستانه شي
(20 ° څخه تر 25 ° C).د کارولو وروسته سمدستي په یخچال کې ټول ریجنټونه خوندي کړئ.
2. ټولې نمونې او کنټرولونه باید د کارونې دمخه وګرځول شي.
3. د hACE2-HRP د حل چمتو کول: د HACE2-HRP غلظت په 1:51 د ډیلیشن تناسب سره د ډیلیشن سره کم کړئ
بفر.د مثال په توګه، د 100 μL HACE2-HRP غلظت د 5.0mL د HRP Dilution Buffer سره ضعیف کړئ.
د HACE2-HRP حل جوړ کړئ.
4. 1× د مینځلو محلول چمتو کول: د 20 × د مینځلو محلول د ډیونیز شوي یا مینځل شوي اوبو سره ضعیف کړئ
د حجم تناسب 1:19.د مثال په توګه، د 20 ملی لیتر 20 × د وینځلو محلول د 380 ملی لیتر ډیونیز شوي یا 380 ملی لیتر سره حل کړئ.
د 400 ملی لیتر 1× د مینځلو محلول جوړولو لپاره منحل شوي اوبه.
【د ازموینې طرزالعمل】
1. په جلا ټیوبونو کې، د چمتو شوي HACE2-HRP محلول 120μL aliquot.
2. په هر ټیوب کې 6 μL کیلیبرټر، نامعلوم نمونې، د کیفیت کنټرول اضافه کړئ او ښه مخلوط کړئ.
3. په 2 مرحله کې چمتو شوي هر مخلوط 100μL ورته مایکروپلیټ څاه ګانو ته انتقال کړئ
د مخکې ډیزاین شوي ازموینې ترتیب ته.
3. پلیټ د پلیټ سیلر سره پوښ کړئ او د 30 دقیقو لپاره په 37 سانتي ګراد کې سینګار کړئ.
4. د پلیټ سیلر لیرې کړئ او پلیټ شاوخوا 300 μL د 1× واش محلول سره د څلور ځله لپاره ومینځئ.
5. پلیټ د کاغذ په تولیه کې ټپ کړئ ترڅو د پښو مینځلو وروسته په څاه کې پاتې مایع لرې کړي.
6. په هر څاه کې 100 μL TMB محلول اضافه کړئ او پلیټ د 20 دقیقو لپاره په 20 - 25 سانتي ګراد کې په تیاره کې وینځئ.
7. هر څاه ته 50 μL Stop محلول اضافه کړئ ترڅو د عکس العمل مخه ونیسي.
8. په مایکروپلیټ ریډر کې د 10 دقیقو په اوږدو کې په 450 nm کې جذب ولولئ (630nm د لاسرسي په توګه
د لوړ دقیق فعالیت لپاره وړاندیز شوی).
