Zestaw do wykrywania przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 (ELISA)
【ZASADA】
Zestaw do wykrywania przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 oparty jest na konkurencyjnej metodologii ELISA.
Przy użyciu oczyszczonej domeny wiążącej receptor (RBD), białka z białka kolca wirusa (S) i komórki gospodarza
receptora ACE2, test ten ma naśladować interakcję neutralizującą wirus-gospodarz.
Kalibratory, kontrole jakości oraz próbki surowicy lub osocza są indywidualnie dobrze wymieszane w rozcieńczeniu
bufor zawierający koniugat hACE2-HRP podzielony na porcje w małych probówkach.Następnie mieszaniny przenosi się do
studzienki mikropłytek zawierające unieruchomiony, rekombinowany fragment RBD SARS-CoV-2 (RBD) dla
inkubacja.Podczas 30-minutowej inkubacji przeciwciała specyficzne dla RBD w kalibratorach, kontroli jakości i
próbki będą konkurować z hACE2-HRP o specyficzne wiązanie RBD unieruchomionego w dołkach.Po
inkubacji, dołki przemywa się 4 razy w celu usunięcia niezwiązanego koniugatu hACE2-HRP.Rozwiązanie
Następnie dodaje się TMB i inkubuje przez 20 minut w temperaturze pokojowej, w wyniku czego powstaje a
niebieski kolor.Pojawienie się koloru zatrzymuje się przez dodanie 1N HCl i absorbancję
mierzono spektrofotometrycznie przy 450 nm.Intensywność powstałego koloru jest proporcjonalna do
ilość obecnego enzymu i jest odwrotnie proporcjonalna do ilości standardów oznaczanych w ten sam sposób.
Poprzez porównanie z krzywą kalibracyjną utworzoną przez dostarczone kalibratory, stężenie
następnie oblicza się przeciwciała neutralizujące w nieznanej próbce.
【MATERIAŁY WYMAGANE, ALE NIE DOSTĘPNE】
1. Woda destylowana lub dejonizowana
2. Pipety precyzyjne: 10μL, 100μL, 200μL i 1 mL
3. Jednorazowe końcówki do pipet
4. Czytnik mikropłytek umożliwiający odczyt absorbancji przy 450 nm.
5. Papier chłonny
6. Papier milimetrowy
7. Mieszadło wirowe lub jego odpowiednik
【POBIERANIE I PRZECHOWYWANIE PRÓB】
1. W tym zestawie można używać próbek surowicy i osocza pobranych w probówkach zawierających K2-EDTA.
2. Próbki należy zamknąć korkiem i można je przechowywać przed oznaczeniem do 48 godzin w temperaturze 2–8°C.
Próbki przechowywane przez dłuższy czas (do 6 miesięcy) należy przed oznaczeniem zamrozić tylko raz w temperaturze -20°C.
Unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
PROTOKÓŁ
【Przygotowanie odczynnika】
1. Przed użyciem wszystkie odczynniki należy wyjąć z lodówki i poczekać, aż osiągną temperaturę pokojową
(20° do 25°C).Natychmiast po użyciu wszystkie odczynniki należy przechowywać w lodówce.
2. Wszystkie próbki i kontrole należy przed użyciem wytrząsnąć na worteksie.
3. Przygotowanie roztworu hACE2-HRP: Rozcieńczyć koncentrat hACE2-HRP w stosunku 1:51 za pomocą Dilution
Bufor.Na przykład rozcieńczyć 100 µl koncentratu hACE2-HRP 5,0 ml buforu do rozcieńczania HRP do
przygotować roztwór hACE2-HRP.
4. 1× Przygotowanie roztworu płuczącego: Rozcieńczyć 20× roztworu płuczącego wodą dejonizowaną lub destylowaną za pomocą
stosunek objętości 1:19.Na przykład rozcieńczyć 20 ml 20× roztworu płuczącego 380 ml dejonizowanego lub
wodę destylowaną, aby przygotować 400 ml 1× roztworu płuczącego.
【Procedura testowa】
1. W oddzielnych probówkach podziel na porcje 120 µl przygotowanego roztworu hACE2-HRP.
2. Do każdej probówki dodać 6 µl kalibratorów, nieznanych próbek i kontroli jakości i dobrze wymieszać.
3. Przenieść 100 µl każdej mieszaniny przygotowanej w kroku 2 do odpowiednich dołków mikropłytki zgodnie z instrukcją
do wcześniej zaprojektowanej konfiguracji testowej.
3. Przykryj płytkę Plate Sealer i inkubuj w temperaturze 37°C przez 30 minut.
4. Usunąć uszczelniacz płytki i przemyć płytkę cztery razy około 300 µl 1× roztworu płuczącego na dołek.
5. Ostukaj płytkę ręcznikiem papierowym, aby usunąć resztki płynu z dołków po etapach przemywania.
6. Dodać 100 µl roztworu TMB do każdego dołka i inkubować płytkę w ciemności w temperaturze 20–25°C przez 20 minut.
7. Dodaj 50 µl roztworu zatrzymującego do każdego dołka, aby zatrzymać reakcję.
8. Odczytać absorbancję w czytniku mikropłytek przy 450 nm w ciągu 10 minut (630 nm jako wyposażenie dodatkowe).
zalecane dla większej precyzji działania).
