SARS-COV-2 nøytraliserende antistoffdeteksjonssett (ELISA)
【PRINSIPP】
SARS-COV-2-nøytraliserende antistoffdeteksjonssett er basert på konkurrerende ELISA-metodikk.
Ved bruk av renset reseptorbindingsdomene (RBD), protein fra det virale piggen (e) proteinet og vertscellen
Reseptor ACE2, denne testen er designet for å etterligne virus-vert nøytraliserende interaksjon.
Kalibratorer, kvalitetskontroller og serum- eller plasmaprøver blandes individuelt godt i fortynning
Buffer som inneholder HACE2-HRP-konjugatet alikvotert i små rør. Deretter overføres blandingene i
Mikroplatbrønnene som inneholder immobilisert rekombinant SARS-COV-2 RBD-fragment (RBD) for
inkubasjon. I løpet av 30-minutters inkubasjonen er RBD-spesifikt antistoff i kalibratorene, QC og
Prøver vil konkurrere med HACE2-HRP for spesifikk binding av RBD-immobilisert i brønnene. Etter
Inkubasjonen, brønnene vaskes 4 ganger for å fjerne ubundet HACE2-HRP-konjugat. En løsning av
TMB blir deretter tilsatt og inkubert i 20 minutter ved romtemperatur, noe som resulterer i utvikling av en
blå farge. Fargeutviklingen stoppes med tillegg av 1N HCl, og absorbansen er
målt spektrofotometrisk ved 450 nm. Intensiteten til den dannede fargen er proporsjonal med
mengden enzym til stede, og er omvendt relatert til mengden standarder som er analysert på samme måte.
Gjennom sammenligning med kalibreringskurven dannet av de medfølgende kalibratorene, konsentrasjonen av
Nøytraliserende antistoffer i den ukjente prøven beregnes deretter.
【Materialer som kreves, men ikke gitt】
1. Destillert eller avionisert vann
2. Presisjonspipetter: 10μl, 100μl, 200 ul og 1 ml
3. Disponible pipett tips
4. Mikroplateleser som er i stand til å lese absorbans ved 450nm.
5. Absorberende papir
6. Grafikkpapir
7. Vortex mikser eller tilsvarende
【Prøvesamling og lagring】
1. Serum- og plasmaprøver samlet i rør som inneholder K2-EDTA kan brukes til dette settet.
2. Prøver skal være avdekket og kan lagres i opptil 48 timer ved 2 ° C - 8 ° C før analysen.
Prøver som holdes i lengre tid (opptil 6 måneder) skal bare frosne en gang ved -20 ° C før analysen.
Unngå gjentatte fryse-tine sykluser.
Protokoll
【Reagenspreparat】
1. Alle reagenser må tas ut fra kjøling og få lov til å gå tilbake til romtemperatur før bruk
(20 ° til 25 ° C). Lagre alle reagenser i kjøleskap raskt etter bruk.
2. Alle prøver og kontroller skal virvleres før bruk.
3. HACE2-HRP Løsning Preparat: Fortynnet HACE2-HRP-konsentrat ved 1: 51 Fortynningsforhold med fortynning
Buffer. Fortynn for eksempel 100 ul HACE2-HRP konsentrat med 5,0 ml HRP fortynningsbuffer til
Lag en HACE2-HRP-løsning.
4. 1 × vaskeløsning Preparat: Fortynn 20 × vaskeoppløsningen med avionisert eller destillert vann med en
volumforhold på 1:19. Fortynn for eksempel 20 ml 20 × vaskeoppløsning med 380 ml avionisert eller
Destillert vann for å lage 400 ml 1 × vaskeoppløsning.
【Testprosedyre】
1. I separate rør, alikvot 120 ul av den forberedte HACE2-HRP-løsningen.
2. Legg til 6 μl kalibratorer, ukjente prøver, kvalitetskontroller i hvert rør og bland godt.
3. Overfør 100 ul av hver blanding fremstilt i trinn 2 til tilsvarende mikroplatebrønner i henhold til
til forhåndsdesignet testkonfigurasjon.
3. Dekk platen med plateforsegler og inkuber ved 37 ° C i 30 minutter.
4. Fjern plateforsegleren og vask platen med omtrent 300 ul 1 × vaskeløsning per brønn for fire ganger.
5. Trykk på platen på papirhåndkle for å fjerne restvæske i brønnene etter å vaske trinn.
6. Tilsett 100 ul TMB -løsning til hver brønn og inkuber platen i mørket ved 20 - 25 ° C i 20 minutter.
7. Legg til 50 μl stoppløsning til hver brønn for å stoppe reaksjonen.
8. Les absorbansen i mikroplateleser på 450 nm innen 10 minutter (630nm som tilbehør er
anbefalt for høyere presisjonsytelse).