SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit (ELISA)
【PRINSIPP】
SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit er basert på konkurrerende ELISA-metodikk.
Ved å bruke renset reseptorbindende domene (RBD), protein fra viral spike (S) protein og vertscellen
reseptor ACE2, er denne testen designet for å etterligne virus-vert nøytraliserende interaksjon.
Kalibratorer, kvalitetskontroller og serum- eller plasmaprøver blandes godt individuelt i fortynning
buffer som inneholder hACE2-HRP-konjugat alikvotert i små rør. Deretter overføres blandingene inn
mikroplatebrønnene som inneholder immobilisert rekombinant SARS-CoV-2 RBD-fragment (RBD) for
inkubasjon. Under den 30-minutters inkubasjonen vil det RBD-spesifikke antistoffet i kalibratorene, QC og
prøver vil konkurrere med hACE2-HRP for spesifikk binding til RBD immobilisert i brønnene. Etter
inkubasjonen vaskes brønnene 4 ganger for å fjerne ubundet hACE2-HRP-konjugat. En løsning av
TMB tilsettes deretter og inkuberes i 20 minutter ved romtemperatur, noe som resulterer i utvikling av en
blå farge. Fargeutviklingen stoppes ved tilsetning av 1N HCl, og absorbansen er
målt spektrofotometrisk ved 450 nm. Intensiteten til fargen som dannes er proporsjonal med
mengde enzym tilstede, og er omvendt relatert til mengden standarder som er analysert på samme måte.
Gjennom sammenligning med kalibreringskurven dannet av de medfølgende kalibratorene, kan konsentrasjonen av
nøytraliserende antistoffer i den ukjente prøven beregnes deretter.
【MATERIALER KREVES MEN IKKE LEVERES】
1. Destillert eller avionisert vann
2. Presisjonspipetter: 10μL, 100μL, 200μL og 1 mL
3. Engangspipettespisser
4. Mikroplateleser som kan lese absorbans ved 450 nm.
5. Absorberende papir
6. Grafpapir
7. Vortex-mikser eller tilsvarende
【PRØVEINNSAMLING OG OPPBEVARING】
1. Serum- og plasmaprøver samlet i rør som inneholder K2-EDTA kan brukes til dette settet.
2. Prøver skal ha lokk og kan oppbevares i opptil 48 timer ved 2 °C - 8 °C før analysen.
Prøver som holdes over lengre tid (opptil 6 måneder) bør kun fryses én gang ved -20 °C før analysen.
Unngå gjentatte fryse-tine-sykluser.
PROTOKOLL
【Forberedelse av reagens】
1. Alle reagenser må tas ut av kjøling og få tilbake til romtemperatur før bruk
(20° til 25°C). Oppbevar alle reagenser i kjøleskapet umiddelbart etter bruk.
2. Alle prøver og kontroller skal vortexes før bruk.
3. Klargjøring av hACE2-HRP-løsning: Fortynn hACE2-HRP-konsentrat ved 1:51 fortynningsforhold med fortynning
Buffer. Fortynn for eksempel 100 μL hACE2-HRP-konsentrat med 5,0 mL HRP-fortynningsbuffer for å
lage en hACE2-HRP-løsning.
4. Klargjøring av 1× vaskeløsning: Fortynn 20× vaskeløsningen med avionisert eller destillert vann med en
volumforhold på 1:19. Fortynn for eksempel 20 mL 20× vaskeløsning med 380 mL avionisert eller
destillert vann for å lage 400 ml 1× vaskeløsning.
【Testprosedyre】
1. I separate rør, alikvoter 120 μL av den tilberedte hACE2-HRP-løsningen.
2. Tilsett 6 μL kalibratorer, ukjente prøver, kvalitetskontroller i hvert rør og bland godt.
3. Overfør 100 μL av hver blanding fremstilt i trinn 2 til tilsvarende mikroplatebrønner iht.
til forhåndsdesignet testkonfigurasjon.
3. Dekk platen med Plate Sealer og inkuber ved 37°C i 30 minutter.
4. Fjern plateforseglingen og vask platen med ca. 300 μL 1× vaskeløsning per brønn i fire ganger.
5. Bank platen på et papirhåndkle for å fjerne væskerester i brønnene etter vasketrinn.
6. Tilsett 100 μL TMB-løsning til hver brønn og inkuber platen i mørke ved 20 - 25 °C i 20 minutter.
7. Tilsett 50 μL stoppløsning til hver brønn for å stoppe reaksjonen.
8. Les av absorbansen i mikroplateleseren ved 450 nm innen 10 minutter (630 nm som tilbehør er
anbefales for høyere presisjonsytelse).