SARS-COV-2 neutraliserende antilichaamdetectiekit (ELISA)
【BEGINSEL】
De SARS-COV-2 neutraliserende antilichaamdetectiekit is gebaseerd op competitieve ELISA-methodologie.
Met behulp van gezuiverd receptorbindend domein (RBD), eiwit van het virale piek (s) eiwit en de gastheercel
Receptor ACE2, deze test is ontworpen om de virus-host neutraliserende interactie na te bootsen.
Kalibrators, kwaliteitscontroles en serum- of plasmamonsters worden individueel goed gemengd in verdunning
Buffer die HACE2-HRP-geconjugeerde aliquoted in kleine buizen bevat. Dan worden de mengsels overgebracht
De microplaatputten die geïmmobiliseerd recombinant SARS-COV-2 RBD-fragment (RBD) bevatten voor
incubatie. Tijdens de incubatie van 30 minuten, het RBD-specifieke antilichaam in de kalibrators, QC en
Monsters zullen concurreren met de HACE2-HRP voor specifieke binding van de RBD geïmmobiliseerd in de putten. Na
De incubatie, de putten worden 4 keer gewassen om ongebonden HACE2-HRP-conjugaat te verwijderen. Een oplossing van
TMB wordt vervolgens toegevoegd en 20 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur, wat resulteert in de ontwikkeling van een
Blauwe kleur. De kleurontwikkeling wordt gestopt met de toevoeging van 1N HCl, en de absorptie is
Gemeten spectrofotometrisch bij 450 nm. De intensiteit van de gevormde kleur is evenredig met de
De hoeveelheid aanwezige enzym en is omgekeerd omgekeerd met de hoeveelheid normen die op dezelfde manier zijn getest.
Door vergelijking met de kalibratiecurve gevormd door de verstrekte kalibrators, de concentratie van
Neutraliserende antilichamen in het onbekende monster worden vervolgens berekend.
【Materialen vereist maar niet voorzien】
1. Gedestilleerd of gedeïoniseerd water
2. Precisiepipetten: 10μl, 100 μl, 200 μl en 1 ml
3. Wegwerppipet -tips
4. Microplaatlezer kan absorptie lezen bij 450 nm.
5. Absorberend papier
6. Grafische papier
7. Vortex -mixer of gelijkwaardig
【Specimen -verzameling en opslag】
1. Serum- en plasmamonsters verzameld in buizen die K2-EDTA bevatten, kunnen voor deze kit worden gebruikt.
2. Monsters moeten worden afgedekt en kunnen tot 48 uur worden bewaard bij 2 ° C - 8 ° C voorafgaand aan de test.
Monsters die langer worden vastgehouden (tot 6 maanden) mogen slechts eenmaal eenmaal bij -20 ° C worden ingevroren voorafgaand aan de test.
Vermijd herhaalde invries-dooi cycli.
PROTOCOL
【Reagensvoorbereiding】
1. Alle reagentia moeten uit de koeling worden gehaald en vóór gebruik naar kamertemperatuur kunnen terugkeren naar kamertemperatuur
(20 ° tot 25 ° C). Bewaar alle reagentia in de koelkast onmiddellijk na gebruik.
2. Alle monsters en bedieningselementen moeten vóór gebruik worden gewerveld.
3. HACE2-HRP-oplossing Bereiding: Verdun HACE2-HRP-concentraat bij 1: 51 verdunningsverhouding met verdunning
Buffer. Verdun bijvoorbeeld 100 ul HACE2-HRP-concentraat met 5,0 ml HRP-verdunningsbuffer tot
Maak een HACE2-HRP-oplossing.
4. 1 × Wasoplossing Bereiding: verdun de 20 × wasoplossing met gedeïoniseerd of gedestilleerd water met een
Volumeverhouding van 1:19. Verdun bijvoorbeeld 20 ml 20 × wasoplossing met 380 ml gedeïoniseerd of
gedestilleerd water om 400 ml 1 × wasoplossing te maken.
【Testprocedure】
1. In afzonderlijke buizen, aliquot 120μl van de bereide HACE2-HRP-oplossing.
2. Voeg 6 μl kalibrators, onbekende monsters, kwaliteitscontroles in elke buis toe en meng goed.
3. Breng 100 μl van elk mengsel in de stap 2 in overeenkomstige microplaatputten over
naar vooraf ontworpen testconfiguratie.
3. Bedek de plaat met plaatafdichter en incubeer 30 minuten bij 37 ° C.
4. Verwijder de plaatafdichter en was de plaat met ongeveer 300 μl 1 x wasoplossing per put voor vier keer.
5. Tik op de plaat op keukenpapier om resterende vloeistof in de putten te verwijderen na wasstappen.
6. Voeg 100 ul TMB -oplossing toe aan elk putje en incubeer de plaat in het donker bij 20 - 25 ° C gedurende 20 minuten.
7. Voeg 50 ul stopoplossing toe aan elk putje om de reactie te stoppen.
8. Lees de absorptie in microplaatlezer binnen 10 minuten bij 450 nm (630 nm als accessoire is
aanbevolen voor hogere precisieprestaties).