SARS-CoV-2 Neutraliserende antilichaamdetectiekit (ELISA)
【BEGINSEL】
De SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit is gebaseerd op competitieve ELISA-methodologie.
Met behulp van gezuiverd receptorbindend domein (RBD), eiwit uit het virale spike-eiwit (S) en de gastheercel
receptor ACE2, is deze test ontworpen om de virus-gastheer-neutraliserende interactie na te bootsen.
Kalibratiemiddelen, kwaliteitscontroles en serum- of plasmamonsters worden afzonderlijk goed verdund gemengd
buffer die hACE2-HRP-conjugaat bevat, verdeeld in kleine buisjes.Vervolgens worden de mengsels overgebracht
de microtiterplaatputjes die het geïmmobiliseerde recombinante SARS-CoV-2 RBD-fragment (RBD) bevatten voor
incubatie.Tijdens de 30 minuten durende incubatie werd het RBD-specifieke antilichaam in de kalibrators, QC en
monsters zullen concurreren met de hACE2-HRP voor specifieke binding van de RBD die in de putjes is geïmmobiliseerd.Na
Na de incubatie worden de putjes viermaal gewassen om ongebonden hACE2-HRP-conjugaat te verwijderen.Een oplossing van
Vervolgens wordt TMB toegevoegd en gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd, wat resulteert in de ontwikkeling van a
blauwe kleur.Door toevoeging van 1N HCl wordt de kleurontwikkeling gestopt en de absorptie wel
spectrofotometrisch gemeten bij 450 nm.De intensiteit van de gevormde kleur is evenredig met de kleur
hoeveelheid aanwezig enzym, en is omgekeerd evenredig met de hoeveelheid standaarden die op dezelfde manier worden getest.
Door vergelijking met de kalibratiecurve gevormd door de meegeleverde kalibratoren, kan de concentratie van
neutraliserende antilichamen in het onbekende monster worden vervolgens berekend.
【MATERIALEN VEREIST MAAR NIET GELEVERD】
1. Gedestilleerd of gedeïoniseerd water
2. Precisiepipetten: 10 μL, 100 μL, 200 μL en 1 ml
3. Wegwerppipettips
4. Microplaatlezer die absorptie bij 450 nm kan lezen.
5. Absorberend papier
6. Grafiekpapier
7. Vortexmixer of gelijkwaardig
【VERZAMELING EN OPSLAG VAN SPECIMEN】
1. Serum- en plasmamonsters verzameld in buisjes met K2-EDTA kunnen voor deze kit worden gebruikt.
2. Monsters moeten worden afgesloten met een dop en kunnen vóór de analyse maximaal 48 uur bij 2 °C - 8 °C worden bewaard.
Monsters die gedurende langere tijd (tot 6 maanden) worden bewaard, mogen vóór de analyse slechts één keer bij -20 °C worden ingevroren.
Vermijd herhaalde vries-dooicycli.
PROTOCOL
【Voorbereiding van reagentia】
1. Alle reagentia moeten vóór gebruik uit de koeling worden gehaald en op kamertemperatuur worden gebracht
(20° tot 25°C).Bewaar alle reagentia onmiddellijk na gebruik in de koelkast.
2. Alle monsters en controles moeten vóór gebruik worden gewerveld.
3. Bereiding van de hACE2-HRP-oplossing: Verdun het hACE2-HRP-concentraat in een verdunningsverhouding van 1:51 met verdunning
Buffer.Verdun bijvoorbeeld 100 μl hACE2-HRP-concentraat met 5,0 ml HRP-verdunningsbuffer om
maak een hACE2-HRP-oplossing.
4. Bereiding van 1× wasoplossing: Verdun de 20× wasoplossing met gedeïoniseerd of gedestilleerd water met een
volumeverhouding van 1:19.Verdun bijvoorbeeld 20 ml 20× wasoplossing met 380 ml gedeïoniseerde of
gedestilleerd water om 400 ml 1× wasoplossing te maken.
【Test procedure】
1. Breng in afzonderlijke buisjes een aliquot van 120 μl van de bereide hACE2-HRP-oplossing aan.
2. Voeg 6 μl kalibrators, onbekende monsters en kwaliteitscontroles toe aan elke buis en meng goed.
3. Breng 100 μl van elk mengsel dat in stap 2 is bereid, over naar de overeenkomstige microtiterplaatwells
naar een vooraf ontworpen testconfiguratie.
3. Bedek de plaat met Plate Sealer en incubeer gedurende 30 minuten bij 37°C.
4. Verwijder de Plate Sealer en was de plaat vier keer met ongeveer 300 μl 1× wasoplossing per well.
5. Tik met de plaat op keukenpapier om de resterende vloeistof in de wells na de wasstappen te verwijderen.
6. Voeg 100 μl TMB-oplossing toe aan elk putje en incubeer de plaat gedurende 20 minuten in het donker bij 20 - 25 °C.
7. Voeg 50 μl stopoplossing toe aan elk putje om de reactie te stoppen.
8. Lees binnen 10 minuten de absorptie af in de microplaatlezer bij 450 nm (630 nm is een accessoire).
aanbevolen voor hogere precisieprestaties).
