SARS-CoV-2 neutralizing एन्टिबडी पत्ता लगाउने किट (ELISA)
【सिद्धान्त】
SARS-CoV-2 neutralizing एन्टिबडी पत्ता लगाउने किट प्रतिस्पर्धी ELISA पद्धतिमा आधारित छ।
शुद्ध रिसेप्टर बाइन्डिङ डोमेन (RBD), भाइरल स्पाइक (S) प्रोटीन र होस्ट सेलबाट प्रोटीन प्रयोग गर्दै
रिसेप्टर ACE2, यो परीक्षण भाइरस-होस्ट तटस्थ अन्तरक्रियाको नक्कल गर्न डिजाइन गरिएको हो।
क्यालिब्रेटरहरू, गुणस्तर नियन्त्रणहरू, र सीरम वा प्लाज्मा नमूनाहरू पातलोमा व्यक्तिगत रूपमा राम्ररी मिसाइन्छ।
hACE2-HRP कन्जुगेट समावेश भएको बफर साना ट्युबहरूमा एलीक्वेटेड।त्यसपछि मिश्रणहरू स्थानान्तरण गरिन्छ
माइक्रोप्लेट कुवाहरू जसमा स्थिर पुनः संयोजक SARS-CoV-2 RBD खण्ड (RBD) को लागि
इन्क्युबेशन।30-मिनेट इन्क्युबेशनको समयमा, क्यालिब्रेटरहरूमा RBD विशिष्ट एन्टिबडी, QC र
नमूनाहरूले इनारहरूमा स्थिर RBD लाई विशेष बन्धनका लागि hACE2-HRP सँग प्रतिस्पर्धा गर्नेछ।पछि
इन्क्युबेशन, अनबाउन्ड hACE2-HRP कन्जुगेट हटाउनको लागि इनारहरू 4 पटक धोइन्छ।को एक समाधान
त्यसपछि TMB थपिन्छ र कोठाको तापक्रममा 20 मिनेटको लागि इन्क्युबेटेड हुन्छ, परिणामस्वरूप a को विकास हुन्छ
नीलो रंग।रंग विकास 1N HCl को थप संग रोकिएको छ, र अवशोषण छ
450 nm मा स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक मापन।बनाइएको रंगको तीव्रता समानुपातिक छ
इन्जाइम को मात्रा उपस्थित छ, र उस्तै मापदण्ड को मात्रा मा उल्टो सम्बन्धित छ।
प्रदान गरिएको क्यालिब्रेटरहरू द्वारा बनाईएको क्यालिब्रेसन वक्रसँग तुलना गरेर, को एकाग्रता
अज्ञात नमूनामा एन्टिबडीहरूलाई बेअसर गर्ने गणना गरिन्छ।
【सामग्री आवश्यक छ तर प्रदान गरिएको छैन】
1. डिस्टिल्ड वा विआयनीकृत पानी
2. सटीक पिपेटहरू: 10μL, 100μL, 200μL र 1 mL
3. डिस्पोजेबल पिपेट सुझावहरू
4. माइक्रोप्लेट रिडर 450nm मा अवशोषण पढ्न सक्षम।
5. शोषक कागज
६. ग्राफ पेपर
7. भोर्टेक्स मिक्सर वा बराबर
【नमूना सङ्कलन र भण्डारण】
1. K2-EDTA युक्त ट्युबहरूमा सङ्कलन गरिएका सीरम र प्लाज्मा नमूनाहरू यो किटको लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ।
2. नमूनाहरू क्याप गरिएको हुनुपर्छ र 2 ° C - 8 ° C मा परख गर्नु अघि 48 घण्टा सम्म भण्डारण गर्न सकिन्छ।
लामो समय (६ महिना सम्म) को लागी राखिएको नमूनाहरू -20 डिग्री सेल्सियस मा एक पटक मात्र जम्मा गरिनु पर्छ परख अघि।
दोहोर्याइएको फ्रिज-थव चक्रबाट बच्नुहोस्।
प्रोटोकल
【अभिकर्मक तयारी】
1. सबै अभिकर्मकहरू रेफ्रिजरेसनबाट बाहिर निकाल्नु पर्छ र प्रयोग गर्नु अघि कोठाको तापक्रममा फर्कन अनुमति दिनुपर्छ
(20° देखि 25°C)।प्रयोग पछि तुरुन्तै फ्रिजमा सबै अभिकर्मकहरू बचत गर्नुहोस्।
2. सबै नमूनाहरू र नियन्त्रणहरू प्रयोग गर्नु अघि vertexed हुनुपर्छ।
3. hACE2-HRP समाधान तयारी: 1: 51 dilution अनुपातमा पातलो hACE2-HRP सांद्रतालाई पातलो पार्नुहोस्।
बफर।उदाहरणका लागि, 100 μL hACE2-HRP कन्सेन्ट्रेटको 5.0mL HRP डिल्युसन बफरसँग पातलो गर्नुहोस्।
hACE2-HRP समाधान बनाउनुहोस्।
4. 1× धुने समाधानको तयारी: 20× धुने घोललाई डियोनाइज्ड वा डिस्टिल्ड पानीले पातलो गर्नुहोस्
1:19 को भोल्युम अनुपात।उदाहरण को लागी, 20 एमएल को 20 × धुने समाधान को 380 एमएल deionized वा पातलो
1× धुने समाधान को 400 एमएल बनाउन डिस्टिल्ड पानी।
【परीक्षण प्रक्रिया】
1. छुट्टाछुट्टै ट्यूबहरूमा, तयार गरिएको hACE2-HRP समाधानको 120μL एलीकोट।
2. प्रत्येक ट्यूबमा 6 μL क्यालिब्रेटरहरू, अज्ञात नमूनाहरू, गुणस्तर नियन्त्रणहरू थप्नुहोस् र राम्ररी मिलाउनुहोस्।
3. चरण 2 मा तयार गरिएको प्रत्येक मिश्रणको 100μL लाई सम्बन्धित माइक्रोप्लेट कुवाहरूमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्
पूर्व डिजाइन परीक्षण कन्फिगरेसनमा।
3. प्लेटलाई प्लेट सिलरले छोप्नुहोस् र 37 डिग्री सेल्सियसमा 30 मिनेटको लागि इन्क्यूबेट गर्नुहोस्।
4. प्लेट सीलर हटाउनुहोस् र प्लेटलाई लगभग 300 μL 1× धुने समाधान प्रति राम्रोसँग चार पटक धुनुहोस्।
5. धुने चरणहरू पछि इनारहरूमा अवशिष्ट तरल हटाउन पेपर तौलियामा प्लेट ट्याप गर्नुहोस्।
6. प्रत्येक इनारमा 100 μL TMB समाधान थप्नुहोस् र प्लेटलाई अँध्यारोमा 20 - 25°C मा २० मिनेटको लागि इन्क्युब्याट गर्नुहोस्।
7. प्रतिक्रिया रोक्न प्रत्येक कुवामा 50 μL स्टप समाधान थप्नुहोस्।
8. 10 मिनेट भित्र 450 nm मा माइक्रोप्लेट रिडरमा अवशोषण पढ्नुहोस् (630nm सहायक रूपमा
उच्च परिशुद्धता प्रदर्शन को लागी सिफारिश गरिएको)।
