SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit (ELISA)
【စာမူ】
SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit သည် ယှဉ်ပြိုင်နိုင်သော ELISA နည်းစနစ်ကို အခြေခံထားသည်။
သန့်စင်ထားသော receptor binding domain (RBD)၊ ဗိုင်းရပ်စ် spike (S) ပရိုတင်းနှင့် လက်ခံဆဲလ်များမှ ပရိုတင်းများကို အသုံးပြုခြင်း၊
receptor ACE2၊ ဤစမ်းသပ်မှုသည် ဗိုင်းရပ်စ်-အိမ်ရှင်ကြားရှိ အပြန်အလှန်ထိန်းညှိမှုကို အတုယူရန် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသည်။
ချိန်ညှိကိရိယာများ၊ အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှုများ၊ နှင့် သွေးရည်ကြည် သို့မဟုတ် ပလာစမာနမူနာများကို ဖျန်ဖြေရာတွင် ကောင်းမွန်စွာ ရောစပ်ထားသည်။
hACE2-HRP conjugate ပါရှိသော ကြားခံကို ပြွန်ငယ်များတွင် ခွဲထားသည်။ ထို့နောက်အရောအနှောများကိုလွှဲပြောင်း
SARS-CoV-2 RBD အပိုင်း (RBD) ပါဝင်သော မိုက်ခရိုပလိတ်တွင်းများ
ပေါက်ဖွားခြင်း။ မိနစ် 30 ပေါက်ဖွားစဉ်အတွင်း၊ ချိန်ညှိကိရိယာများရှိ RBD သီးသန့်ပဋိပစ္စည်း၊ QC နှင့်
နမူနာများသည် ရေတွင်းများတွင် RBD ကို သီးသန့် ချည်နှောင်ထားရန်အတွက် hACE2-HRP နှင့် ယှဉ်ပြိုင်မည်ဖြစ်သည်။ ပြီးနောက်
incubation တွင် unbound hACE2-HRP conjugate ကိုဖယ်ရှားရန်ရေတွင်းများကို 4 ကြိမ်ဆေးကြောပါ။ အဖြေတစ်ခု
ထို့နောက် TMB ကို အခန်းအပူချိန်တွင် မိနစ် 20 မျှ ပေါင်းထည့်ကာ ပေါက်ဖွားလာကာ ကြီးထွားမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။
အပြာရောင်။ 1N HCl ဖြည့်စွက်ခြင်းဖြင့် အရောင်ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုကို ရပ်တန့်လိုက်ပြီး စုပ်ယူမှုမှာ ရပ်တန့်သွားသည်။
450 nm တွင် spectrophotometrically တိုင်းတာသည်။ အရောင်ဖွဲ့စည်းပုံ၏ပြင်းထန်မှုအချိုးကျသည်။
ပစ္စုပ္ပန်အင်ဇိုင်းပမာဏနှင့် တူညီသောနည်းလမ်းဖြင့် တိုင်းတာထားသော စံချိန်စံညွှန်းပမာဏနှင့် ပြောင်းပြန်ဆက်စပ်နေသည်။
ထောက်ပံ့ပေးထားသော calibrators များဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသော ကိုက်ညှိမျဉ်းကွေးနှင့် နှိုင်းယှဉ်ခြင်းအားဖြင့် အာရုံစူးစိုက်မှု
ထို့နောက် အမည်မသိနမူနာရှိ ပဋိပစ္စည်းများ ပျက်ပြယ်စေခြင်းကို တွက်ချက်သည်။
【ပစ္စည်းများ လိုအပ်သော်လည်း မပေးထားပါ။】
1. ပေါင်းခံရည် သို့မဟုတ် အိုင်းယွန်းပြုလုပ်ထားသောရေ
2. တိကျသောပိုက်လိုင်းများ- 10μL၊ 100μL၊200μL နှင့် 1 mL
3. တစ်ခါသုံးပိုက်လိုင်းအကြံပြုချက်များ
4. Microplate reader သည် 450nm တွင် စုပ်ယူမှုအား ဖတ်ရှုနိုင်စွမ်းရှိသည်။
5. စုပ်စက္ကူ
6. ဂရပ်စာရွက်
7. Vortex mixer သို့မဟုတ် ညီမျှသည်။
【နမူနာစုဆောင်းမှုနှင့် သိုလှောင်မှု】
1. K2-EDTA ပါရှိသော ပြွန်များတွင် စုဆောင်းထားသော သွေးရည်ကြည်နှင့် ပလာစမာနမူနာများကို ဤကိရိယာအတွက် အသုံးပြုနိုင်သည်။
2. နမူနာများကို ဖုံးအုပ်ထားသင့်ပြီး စစ်ဆေးမှုမပြုလုပ်မီ 2°C - 8°C တွင် 48 နာရီအထိ သိမ်းဆည်းထားနိုင်သည်။
အချိန်ပိုကြာအောင် ထိန်းသိမ်းထားသော နမူနာများကို (၆ လအထိ) မစစ်ဆေးမီ -20°C တွင် တစ်ကြိမ်သာ အေးခဲထားသင့်သည်။
ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲနေသော သံသရာကို ရှောင်ပါ။
ပရိုတိုကော
【ဓာတ်ကူပစ္စည်းပြင်ဆင်ခြင်း။】
1. ဓါတ်ဆေးအားလုံးကို ရေခဲသေတ္တာမှ ထုတ်ယူပြီး အသုံးမပြုမီ အခန်းအပူချိန်သို့ ပြန်ခွင့်ပြုပါ။
(20° မှ 25°C)။ အသုံးပြုပြီးပါက ရေခဲသေတ္တာထဲတွင် ဓာတ်ပစ္စည်းများအားလုံးကို ချက်ချင်းသိမ်းဆည်းပါ။
2. နမူနာများနှင့် ထိန်းချုပ်မှုများကို အသုံးမပြုမီ vortexed လုပ်သင့်သည်။
3. hACE2-HRP ဖြေရှင်းချက်ပြင်ဆင်မှု- hACE2-HRP အာရုံစူးစိုက်မှုကို 1:51 ပျော့ပျောင်းမှုအချိုးဖြင့် ပျော့ပျောင်းစေခြင်း
ကြားခံ။ ဥပမာအားဖြင့်၊ HACE2-HRP အာရုံစူးစိုက်မှု 100 μL ကို HRP Dilution Buffer ၏ 5.0mL ဖြင့် ဖျန်းပေးပါ။
hACE2-HRP ဖြေရှင်းချက်ကို ပြုလုပ်ပါ။
4. 1× Wash Solution Preparation- 20× Wash Solution ကို deionized သို့မဟုတ် ပေါင်းခံရေဖြင့် အအေးခံပြီး ဖျော်ထားပါ။
ထုထည်အချိုးအစား 1:19 ။ ဥပမာအားဖြင့်၊ 20× Wash Solution ၏ 20 mL ကို deionized သို့မဟုတ် 380 mL ဖြင့် အအေးခံပါ။
ပေါင်းခံရေ 400 mL ကို 1× Wash Solution ပြုလုပ်ရန်။
【စမ်းသပ်မှုလုပ်ထုံးလုပ်နည်း】
1. သီးခြားပြွန်များတွင်၊ ပြင်ဆင်ထားသော hACE2-HRP ဖြေရှင်းချက်၏ 120μL ကို aliquot ။
2. 6 μL ဓာတ်ညှိကိရိယာများ၊ အမည်မသိနမူနာများ၊ အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှုများကို ပြွန်တစ်ခုစီတွင် ထည့်ပြီး ကောင်းစွာရောမွှေပါ။
3. အဆင့် 2 တွင် ပြင်ဆင်ထားသော အရောအနှောတစ်ခုစီ၏ 100μL ကို သက်ဆိုင်ရာ မိုက်ခရိုပလိတ်တွင်းများထဲသို့ လွှဲပြောင်းပါ။
ကြိုတင်ဒီဇိုင်းရေးဆွဲထားသော စမ်းသပ်ဖွဲ့စည်းမှုသို့။
3. ပန်းကန်ပြားကို Plate Sealer ဖြင့် ဖုံးအုပ်ပြီး 37°C တွင် မိနစ် 30 ကြာ ဖုတ်ပါ။
4. Plate Sealer ကို ဖယ်ရှားပြီး ရေတွင်းတစ်ခုလျှင် 1× Wash Solution 300 μL ခန့်ဖြင့် ပန်းကန်ပြားကို လေးကြိမ်ခန့် ဆေးကြောပါ။
5. ဆေးကြောပြီးနောက် ရေတွင်းရှိ ကျန်အရည်များကို ဖယ်ရှားရန် စက္ကူသုတ်ပုဝါပေါ်တွင် ပန်းကန်ပြားကို နှိပ်ပါ။
6. ရေတွင်းတစ်ခုစီတွင် TMB Solution 100 μL ထည့်ပြီး ပန်းကန်ပြားကို အမှောင်ထဲတွင် 20 - 25°C တွင် မိနစ် 20 ခန့်ထားပါ။
7. တုံ့ပြန်မှုကိုရပ်တန့်ရန် ရေတွင်းတစ်ခုစီတွင် Stop Solution 50 μL ကိုထည့်ပါ။
8. microplate reader တွင် 10 မိနစ်အတွင်း 450 nm တွင် စုပ်ယူမှုကို ဖတ်ပါ (ဆက်စပ်ပစ္စည်းအဖြစ် 630nm၊
ပိုမိုတိကျသောစွမ်းဆောင်ရည်အတွက်အကြံပြုထားသည်) ။