Kitt ta' Sejbien ta' Antikorpi Newtralizzanti SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINĊIPJU】
Is-SARS-CoV-2 Newtraliizing Antibody Detection Kit huwa bbażat fuq metodoloġija ELISA kompetittiva.
Bl-użu ta 'dominju ta' rbit tar-riċettur purifikat (RBD), proteina mill-proteina spike virali (S) u ċ-ċellula ospitanti
riċettur ACE2, dan it-test huwa ddisinjat biex jimita l-interazzjoni newtralizzanti virus-host.
Kalibraturi, Kontrolli tal-Kwalità, u kampjuni tas-serum jew tal-plażma jitħalltu individwalment sew fid-dilwizzjoni
buffer li fih konjugat hACE2-HRP alikkwotat f'tubi żgħar.Imbagħad it-taħlitiet jiġu trasferiti ġewwa
il-bjar tal-mikroplate li fihom framment RBD SARS-CoV-2 rikombinanti immobilizzat (RBD) għal
inkubazzjoni.Matul l-inkubazzjoni ta '30 minuta, l-antikorp speċifiku RBD fil-kalibraturi, QC u
kampjuni se jikkompetu mal-hACE2-HRP għal rbit speċifiku tal-RBD immobilizzat fil-bjar.Wara
l-inkubazzjoni, il-bjar jinħaslu 4 darbiet biex jitneħħa l-konjugat hACE2-HRP mhux marbut.Soluzzjoni ta
TMB imbagħad jiġi miżjud u inkubat għal 20 minuta f'temperatura tal-kamra, li jirriżulta fl-iżvilupp ta 'a
kulur blu.L-iżvilupp tal-kulur jitwaqqaf biż-żieda ta '1N HCl, u l-assorbiment huwa
imkejla spettrofotometrikament f'450 nm.L-intensità tal-kulur iffurmat hija proporzjonali għall-
ammont ta 'enżima preżenti, u huwa inversament relatat mal-ammont ta' standards ttestjati bl-istess mod.
Permezz ta 'tqabbil mal-kurva tal-kalibrazzjoni ffurmata mill-kalibraturi pprovduti, il-konċentrazzjoni ta'
imbagħad jiġu kkalkulati antikorpi newtralizzanti fil-kampjun mhux magħruf.
【MATERJALI MEĦTIEĠA IMMA MHUX PROVVDUTI】
1. Ilma distillat jew dejonizzat
2. Pipetti ta 'preċiżjoni: 10μL, 100μL, 200μL u 1 mL
3. Truf tal-pipetta li jintremew
4. Microplate reader kapaċi jaqra l-assorbiment f'450nm.
5. Karta assorbenti
6. Karta grafika
7. Vortex mixer jew ekwivalenti
【ĠBIR U ĦAŻNA TA' KAMPJUNI】
1. Kampjuni tas-serum u tal-Plażma miġbura f'tubi li fihom K2-EDTA jistgħu jintużaw għal dan il-kit.
2. Il-kampjuni għandhom ikunu mgħottija u jistgħu jinħażnu sa 48 siegħa f'2 °C - 8 °C qabel l-assaġġ.
Il-kampjuni miżmuma għal żmien itwal (sa 6 xhur) għandhom jiġu ffriżati darba biss f'-20 °C qabel l-analiżi.
Evita ċikli ripetuti ta' ffriżar u tidwib.
PROTOKOLL
【Preparazzjoni tar-Reaġent】
1. Ir-reaġenti kollha għandhom jinħarġu mir-refriġerazzjoni u jitħallew jerġgħu lura għat-temperatura tal-kamra qabel l-użu
(20° sa 25°C).Ħlief ir-reaġenti kollha fil-friġġ minnufih wara l-użu.
2. Il-kampjuni u l-kontrolli kollha għandhom jiġu vortexed qabel l-użu.
3. Preparazzjoni tas-Soluzzjoni hACE2-HRP: Ħallat il-konċentrat ta' hACE2-HRP f'proporzjon ta' dilwizzjoni 1: 51 b'Dilwizzjoni
Buffer.Pereżempju, ħallat 100 μL ta' konċentrat hACE2-HRP b'5.0mL ta' HRP Dilution Buffer għal
agħmel soluzzjoni hACE2-HRP.
4. Preparazzjoni tas-Soluzzjoni tal-Aħsel 1×: Iddilwa s-Soluzzjoni tal-Aħsel 20× b’ilma dejonizzat jew distillat b’
proporzjon tal-volum ta '1:19.Pereżempju, iddilwa 20 mL ta’ 20× Soluzzjoni tal-Aħsel bi 380 mL ta’ dejonizzat jew
ilma distillat biex tagħmel 400 mL ta '1× Soluzzjoni tal-Aħsel.
【Proċedura tat-Test】
1. F'tubi separati, alikwott 120μL tas-Soluzzjoni ppreparata hACE2-HRP.
2. Żid 6 μL ta' kalibraturi, kampjuni mhux magħrufa, kontrolli tal-kwalità f'kull tubu u ħawwad sew.
3. Ittrasferixxi 100μL ta' kull taħlita ppreparata fil-pass 2 fil-bjar tal-mikroplate korrispondenti skond
għal konfigurazzjoni tat-test iddisinjata minn qabel.
3. Għatti l-pjanċa bi Plate Sealer u inkuba f'37°C għal 30 minuta.
4. Neħħi l-Plate Sealer u aħsel il-pjanċa b'madwar 300 μL ta' 1× Wash Solution għal kull bir għal erba' darbiet.
5. Tektek il-pjanċa fuq xugaman tal-karta biex tneħħi l-likwidu residwu fil-bjar wara l-passi tal-ħasil.
6. Żid 100 μL ta' Soluzzjoni TMB ma' kull bir u inkuba l-pjanċa fid-dlam f'20 - 25°C għal 20 minuta.
7. Żid 50 μL ta' Stop Solution ma' kull bir biex twaqqaf ir-reazzjoni.
8. Aqra l-assorbiment fil-qarrej tal-mikroplate f'450 nm fi żmien 10 minuti (630nm bħala aċċessorju huwa
rakkomandat għal prestazzjoni ta 'preċiżjoni ogħla).
