Kit Pengesanan Antibodi Meneutralkan SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINSIP】
Kit Pengesanan Antibodi Meneutralkan SARS-CoV-2 adalah berdasarkan metodologi ELISA yang kompetitif.
Menggunakan domain pengikat reseptor yang dimurnikan (RBD), protein daripada protein spike virus (S) dan sel perumah
reseptor ACE2, ujian ini direka bentuk untuk meniru interaksi peneutralan hos virus.
Kalibrator, Kawalan Kualiti, dan sampel serum atau plasma secara individu dicampur dengan baik dalam pencairan
penimbal yang mengandungi konjugat hACE2-HRP diasingkan dalam tiub kecil.Kemudian campuran dipindahkan ke dalam
telaga mikroplat yang mengandungi serpihan (RBD) SARS-CoV-2 RBD rekombinan tidak bergerak untuk
pengeraman.Semasa pengeraman selama 30 minit, antibodi khusus RBD dalam penentukur, QC dan
sampel akan bersaing dengan hACE2-HRP untuk mengikat khusus RBD yang tidak bergerak di dalam telaga.Selepas
pengeraman, telaga dicuci 4 kali untuk mengeluarkan konjugat hACE2-HRP yang tidak terikat.Satu penyelesaian daripada
TMB kemudiannya ditambah dan diinkubasi selama 20 minit pada suhu bilik, menghasilkan perkembangan a
warna biru.Perkembangan warna dihentikan dengan penambahan 1N HCl, dan penyerapan adalah
diukur secara spektrofotometri pada 450 nm.Keamatan warna yang terbentuk adalah berkadar dengan
jumlah enzim hadir, dan berkait songsang dengan jumlah piawaian yang diuji dengan cara yang sama.
Melalui perbandingan dengan lengkung penentukuran yang dibentuk oleh penentukuran yang disediakan, kepekatan
antibodi meneutralkan dalam sampel yang tidak diketahui kemudiannya dikira.
【BAHAN DIPERLUKAN TETAPI TIDAK DISEDIAKAN】
1. Air suling atau ternyahion
2. Pipet ketepatan: 10μL, 100μL, 200μL dan 1 mL
3. Petua pipet pakai buang
4. Pembaca plat mikro mampu membaca penyerapan pada 450nm.
5. Kertas penyerap
6. Kertas graf
7. Pengadun vorteks atau setara
【PENGUMPULAN DAN PENYIMPANAN SPECIMEN】
1. Sampel serum dan Plasma yang dikumpul dalam tiub yang mengandungi K2-EDTA boleh digunakan untuk kit ini.
2. Spesimen hendaklah ditutup dan boleh disimpan sehingga 48 jam pada 2 °C - 8 °C sebelum ujian.
Spesimen yang dipegang untuk masa yang lebih lama (sehingga 6 bulan) hendaklah dibekukan sekali sahaja pada -20 °C sebelum ujian.
Elakkan kitaran beku-cair berulang.
PROTOKOL
【Penyediaan Reagen】
1. Semua reagen mesti dikeluarkan dari peti sejuk dan dibenarkan kembali ke suhu bilik sebelum digunakan
(20° hingga 25°C).Simpan semua reagen di dalam peti sejuk dengan segera selepas digunakan.
2. Semua sampel dan kawalan hendaklah dipusingkan sebelum digunakan.
3. Penyediaan Penyelesaian hACE2-HRP: Cairkan pekat hACE2-HRP pada nisbah pencairan 1: 51 dengan Pencairan
Penampan.Contohnya, cairkan 100 μL pekat hACE2-HRP dengan 5.0mL Penampan Pencairan HRP kepada
buat penyelesaian hACE2-HRP.
4. 1× Penyediaan Larutan Cuci: Cairkan Larutan Cuci 20 × dengan air ternyahion atau suling dengan
nisbah isipadu 1:19.Contohnya, cairkan 20 mL Larutan Cuci 20× dengan 380 mL ternyahiion atau
air suling untuk membuat 400 mL 1× Wash Solution.
【Prosedur Ujian】
1. Dalam tiub berasingan, aliquot 120μL Penyelesaian hACE2-HRP yang disediakan.
2. Tambah 6 μL kalibrator, sampel yang tidak diketahui, kawalan kualiti dalam setiap tiub dan gaul rata.
3. Pindahkan 100μL setiap campuran yang disediakan dalam langkah 2 ke dalam telaga mikroplat yang sepadan mengikut
kepada konfigurasi ujian yang telah direka bentuk terlebih dahulu.
3. Tutup pinggan dengan Plate Sealer dan eramkan pada suhu 37°C selama 30 minit.
4. Tanggalkan Pengedap Plat dan basuh pinggan dengan lebih kurang 300 μL 1× Larutan Cuci setiap perigi selama empat kali.
5. Ketuk pinggan pada tuala kertas untuk mengeluarkan sisa cecair di dalam telaga selepas langkah mencuci.
6. Tambahkan 100 μL TMB Solution ke dalam setiap perigi dan eramkan plat dalam gelap pada suhu 20 - 25°C selama 20 minit.
7. Tambah 50 μL Stop Solution pada setiap perigi untuk menghentikan tindak balas.
8. Baca penyerapan dalam pembaca plat mikro pada 450 nm dalam masa 10 minit (630nm sebagai aksesori adalah
disyorkan untuk prestasi ketepatan yang lebih tinggi).
