SARS-CoV-2 Meneutralkan Kit Pengesanan Antibodi (ELISA)
【Prinsip】
Kit pengesanan antibodi SARS-COV-2 yang meneutralkan berdasarkan metodologi ELISA yang kompetitif.
Menggunakan domain pengikat reseptor yang disucikan (RBD), protein dari protein spike (s) virus dan sel tuan rumah
Reseptor ACE2, ujian ini direka untuk meniru interaksi meneutralkan virus-host.
Calibrators, kawalan kualiti, dan sampel serum atau plasma dicampur dengan baik dalam pencairan
Penampan yang mengandungi konjugasi HACE2-HRP aliquoted dalam tiub kecil. Maka campuran dipindahkan masuk
telaga mikroplat yang mengandungi serpihan SARS-COV-2 RBD yang tidak bergerak (RBD) untuk
Inkubasi. Semasa pengeraman selama 30 minit, antibodi spesifik RBD di kalibrator, QC dan
Sampel akan bersaing dengan HACE2-HRP untuk mengikat spesifik RBD yang tidak bergerak di telaga. Selepas
Inkubasi, telaga dibasuh 4 kali untuk menghilangkan konjugasi HACE2-HRP yang tidak terkawal. Penyelesaian
TMB kemudian ditambah dan diinkubasi selama 20 minit pada suhu bilik, mengakibatkan perkembangan a
warna biru. Pembangunan warna dihentikan dengan penambahan 1N HCl, dan penyerapan adalah
Spectrophotometrically diukur pada 450 nm. Keamatan warna yang terbentuk adalah berkadar dengan
Jumlah enzim hadir, dan terbalik secara terbalik dengan jumlah piawaian yang diuji dengan cara yang sama.
Melalui perbandingan dengan lengkung penentukuran yang dibentuk oleh calibrator yang disediakan, kepekatan
Meneutralkan antibodi dalam sampel yang tidak diketahui kemudian dikira.
【Bahan yang diperlukan tetapi tidak disediakan】
1. Air sulingan atau berair
2. Pipet ketepatan: 10μl, 100μl, 200μl dan 1 ml
3. Petua pipet pakai buang
4. Pembaca Microplate yang mampu membaca penyerapan pada 450nm.
5. Kertas penyerap
6. Kertas graf
7. pengadun vorteks atau setaraf
【Koleksi dan Penyimpanan Spesimen】
1. Serum dan sampel plasma yang dikumpulkan dalam tiub yang mengandungi K2-EDTA boleh digunakan untuk kit ini.
2. Spesimen harus dihadkan dan boleh disimpan sehingga 48 jam pada 2 ° C - 8 ° C sebelum menguji.
Spesimen yang dipegang untuk masa yang lebih lama (sehingga 6 bulan) harus dibekukan hanya sekali pada -20 ° C sebelum ujian.
Elakkan kitaran beku-cair berulang.
Protokol
【Penyediaan reagen】
1. Semua reagen mesti diambil dari penyejukan dan dibenarkan kembali ke suhu bilik sebelum digunakan
(20 ° hingga 25 ° C). Simpan semua reagen dalam peti sejuk dengan segera selepas digunakan.
2. Semua sampel dan kawalan hendaklah dilancarkan sebelum digunakan.
3. Penyediaan Penyediaan HACE2-HRP: Cairkan HACE2-HRP Berkonsentrasi pada nisbah pencairan 1: 51 dengan pencairan
Penampan. Sebagai contoh, cairkan 100 μl hace2-hrp menumpukan dengan 5.0ml penampan pencairan HRP ke
Buat penyelesaian HACE2-HRP.
4.
Nisbah kelantangan 1:19. Contohnya, cairkan 20 ml larutan 20 × cuci dengan 380 ml deionized atau
Air suling untuk membuat 400 ml 1 × larutan basuh.
【Prosedur ujian】
1. Dalam tiub berasingan, aliquot 120μl penyelesaian HACE2-HRP yang disediakan.
2. Tambah 6 μl calibrators, sampel yang tidak diketahui, kawalan kualiti dalam setiap tiub dan kacau dengan baik.
3. Pemindahan 100μl setiap campuran yang disediakan dalam langkah 2 ke dalam telaga mikroplat yang sepadan
untuk konfigurasi ujian yang telah direka bentuk.
3. Tutup plat dengan pengedap plat dan inkubasi pada suhu 37 ° C selama 30 minit.
4. Keluarkan pengedap plat dan basuh plat dengan kira -kira 300 μl 1 × larutan basuh setiap sumur empat kali.
5. Ketik plat pada tuala kertas untuk mengeluarkan cecair sisa di telaga selepas mencuci langkah.
6. Tambah 100 μl larutan TMB untuk setiap sumur dan inkabasi plat dalam gelap pada 20 - 25 ° C selama 20 minit.
7. Tambah 50 μl penyelesaian berhenti ke setiap telaga untuk menghentikan tindak balas.
8. Baca penyerapan dalam pembaca mikroplat pada 450 nm dalam masa 10 minit (630nm sebagai aksesori
disyorkan untuk prestasi ketepatan yang lebih tinggi).