SARS-CoV-2 न्यूट्रलायझिंग अँटीबॉडी डिटेक्शन किट (ELISA)
【तत्त्व】
SARS-CoV-2 न्यूट्रलायझिंग अँटीबॉडी डिटेक्शन किट स्पर्धात्मक ELISA पद्धतीवर आधारित आहे.
शुद्ध रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी), व्हायरल स्पाइक (एस) प्रथिने आणि होस्ट सेलमधील प्रथिने वापरणे
रिसेप्टर ACE2, ही चाचणी व्हायरस-होस्ट तटस्थ परस्परसंवादाची नक्कल करण्यासाठी डिझाइन केलेली आहे.
कॅलिब्रेटर, गुणवत्ता नियंत्रणे आणि सीरम किंवा प्लाझमाचे नमुने वैयक्तिकरित्या पातळ केले जातात.
hACE2-HRP संयुग्मित असलेले बफर लहान नळ्यांमध्ये अलिकोट केलेले आहे.मग मिश्रण हस्तांतरित केले जातात
मायक्रोप्लेट विहिरी ज्यामध्ये स्थिर रीकॉम्बीनंट SARS-CoV-2 RBD फ्रॅगमेंट (RBD) आहे
उष्मायन30-मिनिटांच्या उष्मायन दरम्यान, कॅलिब्रेटरमधील RBD विशिष्ट प्रतिपिंड, QC आणि
विहिरींमध्ये स्थिर RBD ला विशिष्ट बंधनकारक करण्यासाठी नमुने hACE2-HRP शी स्पर्धा करतील.नंतर
उष्मायनात, अनबाउंड hACE2-HRP संयुग्म काढून टाकण्यासाठी विहिरी 4 वेळा धुतल्या जातात.चा उपाय
त्यानंतर TMB जोडले जाते आणि खोलीच्या तपमानावर 20 मिनिटे उष्मायन केले जाते, परिणामी a विकसित होते
निळा रंग.1N HCl च्या व्यतिरिक्त रंगाचा विकास थांबला आहे आणि शोषकता आहे
450 nm वर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक पद्धतीने मोजले.तयार झालेल्या रंगाची तीव्रता च्या प्रमाणात असते
एंझाइमचे प्रमाण उपस्थित आहे आणि त्याच प्रकारे तपासलेल्या मानकांच्या प्रमाणाशी उलट संबंधित आहे.
प्रदान केलेल्या कॅलिब्रेटरद्वारे तयार केलेल्या कॅलिब्रेशन वक्रशी तुलना करून, एकाग्रता
अज्ञात नमुन्यातील ऍन्टीबॉडीज तटस्थ करणे नंतर मोजले जाते.
【आवश्यक साहित्य पण दिलेले नाही】
1. डिस्टिल्ड किंवा डीआयोनाइज्ड पाणी
2. अचूक पिपेट्स: 10μL, 100μL, 200μL आणि 1 mL
3. डिस्पोजेबल विंदुक टिपा
4. मायक्रोप्लेट रीडर 450nm वर शोषक वाचण्यास सक्षम आहे.
5. शोषक कागद
6. आलेख कागद
7. व्होर्टेक्स मिक्सर किंवा समतुल्य
【नमुना संकलन आणि साठवण】
1. K2-EDTA असलेल्या ट्यूबमध्ये गोळा केलेले सीरम आणि प्लाझ्मा नमुने या किटसाठी वापरले जाऊ शकतात.
2. नमुने कॅप केलेले असले पाहिजेत आणि 48 तासांपर्यंत 2 °C - 8 °C तापमानात ठेवण्याआधी साठवले जाऊ शकतात.
जास्त काळ (6 महिन्यांपर्यंत) ठेवलेले नमुने केवळ एकदाच -20 डिग्री सेल्सिअस तापमानात तपासणीपूर्वी गोठवले जावेत.
वारंवार फ्रीझ-थॉ सायकल टाळा.
प्रोटोकॉल
【अभिकर्मक तयारी】
1. सर्व अभिकर्मक रेफ्रिजरेशनमधून बाहेर काढले पाहिजेत आणि वापरण्यापूर्वी खोलीच्या तपमानावर परत येऊ दिले पाहिजेत
(20° ते 25°C).सर्व अभिकर्मक वापरल्यानंतर ताबडतोब रेफ्रिजरेटरमध्ये जतन करा.
2. सर्व नमुने आणि नियंत्रणे वापरण्यापूर्वी व्हर्टेक्स केले पाहिजेत.
3. hACE2-HRP सोल्यूशन तयार करणे: dilution सह 1:51 dilution ratio वर hACE2-HRP सांद्रता पातळ करा
बफर.उदाहरणार्थ, 100 μL hACE2-HRP कॉन्सन्ट्रेट 5.0mL HRP डायल्युशन बफरसह पातळ करा
hACE2-HRP सोल्यूशन बनवा.
4. 1× वॉश सोल्यूशन तयार करणे: 20× वॉश सोल्यूशन डीआयोनाइज्ड किंवा डिस्टिल्ड वॉटरसह पातळ करा
1:19 चे व्हॉल्यूम गुणोत्तर.उदाहरणार्थ, 20 × वॉश सोल्यूशनचे 20 मिली डीआयोनाइज्ड किंवा 380 मिली पातळ करा.
1× वॉश सोल्यूशनचे 400 एमएल तयार करण्यासाठी डिस्टिल्ड वॉटर.
【चाचणी पद्धत】
1. वेगळ्या नळ्यांमध्ये, तयार केलेल्या hACE2-HRP सोल्युशनचे 120μL अलिकट.
2. प्रत्येक ट्यूबमध्ये 6 μL कॅलिब्रेटर, अज्ञात नमुने, गुणवत्ता नियंत्रणे जोडा आणि चांगले मिसळा.
3. चरण 2 मध्ये तयार केलेल्या प्रत्येक मिश्रणाचे 100μL संबंधित मायक्रोप्लेट विहिरींमध्ये हस्तांतरित करा
पूर्वडिझाइन केलेल्या चाचणी कॉन्फिगरेशनसाठी.
3. प्लेट सीलरने प्लेट झाकून ठेवा आणि 37°C वर 30 मिनिटे उबवा.
4. प्लेट सीलर काढा आणि सुमारे 300 μL 1× वॉश सोल्यूशन प्रति वेल चार वेळा धुवा.
5. पायऱ्या धुतल्यानंतर विहिरींमधील अवशिष्ट द्रव काढून टाकण्यासाठी कागदाच्या टॉवेलवर प्लेट टॅप करा.
6. प्रत्येक विहिरीला 100 μL TMB सोल्युशन घाला आणि प्लेटला 20 - 25°C तापमानात 20 मिनिटे अंधारात ठेवा.
7. प्रतिक्रिया थांबवण्यासाठी प्रत्येक विहिरीला 50 μL स्टॉप सोल्युशन घाला.
8. मायक्रोप्लेट रीडरमधील शोषकता 10 मिनिटांत 450 nm वर वाचा (ॲक्सेसरी म्हणून 630nm
उच्च परिशुद्धता कार्यक्षमतेसाठी शिफारस केलेले).
