SARS-CoV-2 ന്യൂട്രലൈസിംഗ് ആൻ്റിബോഡി ഡിറ്റക്ഷൻ കിറ്റ് (ELISA)
【തത്വം】
SARS-CoV-2 ന്യൂട്രലൈസിംഗ് ആൻ്റിബോഡി ഡിറ്റക്ഷൻ കിറ്റ് മത്സരാധിഷ്ഠിത ELISA രീതിശാസ്ത്രത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്.
ശുദ്ധീകരിച്ച റിസപ്റ്റർ ബൈൻഡിംഗ് ഡൊമെയ്ൻ (RBD), വൈറൽ സ്പൈക്ക് (S) പ്രോട്ടീൻ, ഹോസ്റ്റ് സെൽ എന്നിവയിൽ നിന്നുള്ള പ്രോട്ടീൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു
റിസപ്റ്റർ ACE2, വൈറസ്-ഹോസ്റ്റ് ന്യൂട്രലൈസിംഗ് ഇൻ്ററാക്ഷനെ അനുകരിക്കുന്നതിനാണ് ഈ പരിശോധന രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിരിക്കുന്നത്.
കാലിബ്രേറ്ററുകൾ, ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണങ്ങൾ, സെറം അല്ലെങ്കിൽ പ്ലാസ്മ സാമ്പിളുകൾ എന്നിവ വ്യക്തിഗതമായി നേർപ്പിക്കുന്നതിൽ നന്നായി കലർത്തിയിരിക്കുന്നു.
ചെറിയ ട്യൂബുകളിൽ അലിക്യൂട്ട് ചെയ്ത hACE2-HRP സംയോജനം അടങ്ങിയ ബഫർ. അതിനുശേഷം മിശ്രിതങ്ങൾ അകത്തേക്ക് മാറ്റുന്നു
ഇമോബിലൈസ്ഡ് റീകോമ്പിനൻ്റ് SARS-CoV-2 RBD ഫ്രാഗ്മെൻ്റ് (RBD) അടങ്ങിയ മൈക്രോപ്ലേറ്റ് കിണറുകൾ
ഇൻകുബേഷൻ. 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേഷൻ സമയത്ത്, കാലിബ്രേറ്ററുകളിലെ ആർബിഡി നിർദ്ദിഷ്ട ആൻ്റിബോഡി, ക്യുസി,
കിണറുകളിൽ നിശ്ചലമാക്കിയ ആർബിഡിയെ പ്രത്യേകമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് സാമ്പിളുകൾ hACE2-HRP-യുമായി മത്സരിക്കും. ശേഷം
ഇൻകുബേഷൻ സമയത്ത്, അൺബൗണ്ട് hACE2-HRP സംയോജനം നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി കിണറുകൾ 4 തവണ കഴുകുന്നു. ഒരു പരിഹാരം
TMB പിന്നീട് ചേർത്ത് 20 മിനിറ്റ് ഊഷ്മാവിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുന്നു, അതിൻ്റെ ഫലമായി a
നീല നിറം. 1N HCl ചേർക്കുന്നതോടെ വർണ്ണ വികസനം നിർത്തുന്നു, ആഗിരണം ചെയ്യപ്പെടുന്നു
450 nm-ൽ സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമെട്രിക് ആയി അളന്നു. രൂപപ്പെട്ട നിറത്തിൻ്റെ തീവ്രത ആനുപാതികമാണ്
എൻസൈമിൻ്റെ അളവ്, അതേ രീതിയിൽ വിലയിരുത്തിയ മാനദണ്ഡങ്ങളുടെ അളവുമായി വിപരീതമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.
നൽകിയിരിക്കുന്ന കാലിബ്രേറ്ററുകൾ രൂപപ്പെടുത്തിയ കാലിബ്രേഷൻ വക്രവുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുന്നതിലൂടെ, ഏകാഗ്രത
അജ്ഞാത സാമ്പിളിലെ ന്യൂട്രലൈസിംഗ് ആൻ്റിബോഡികൾ പിന്നീട് കണക്കാക്കുന്നു.
【മെറ്റീരിയലുകൾ ആവശ്യമാണ് എന്നാൽ നൽകിയിട്ടില്ല】
1. വാറ്റിയെടുത്ത അല്ലെങ്കിൽ ഡീയോണൈസ്ഡ് വെള്ളം
2. പ്രിസിഷൻ പൈപ്പറ്റുകൾ: 10μL, 100μL,200μL, 1 mL
3. ഡിസ്പോസിബിൾ പൈപ്പറ്റ് ടിപ്പുകൾ
4. 450nm-ൽ ആഗിരണം ചെയ്യാൻ കഴിവുള്ള മൈക്രോപ്ലേറ്റ് റീഡർ.
5. ആഗിരണം ചെയ്യപ്പെടുന്ന പേപ്പർ
6. ഗ്രാഫ് പേപ്പർ
7. വോർട്ടക്സ് മിക്സർ അല്ലെങ്കിൽ തത്തുല്യമായത്
【മാതൃകാ ശേഖരണവും സംഭരണവും】
1. K2-EDTA അടങ്ങിയ ട്യൂബുകളിൽ ശേഖരിക്കുന്ന സെറം, പ്ലാസ്മ സാമ്പിളുകൾ ഈ കിറ്റിനായി ഉപയോഗിക്കാം.
2. സാമ്പിളുകൾ ക്യാപ് ചെയ്തിരിക്കണം കൂടാതെ 2 °C - 8 °C താപനിലയിൽ 48 മണിക്കൂർ വരെ സൂക്ഷിക്കാം.
കൂടുതൽ നേരം (6 മാസം വരെ) സൂക്ഷിച്ചിരിക്കുന്ന മാതൃകകൾ -20 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഒരിക്കൽ മാത്രം ഫ്രീസുചെയ്യണം.
ആവർത്തിച്ചുള്ള ഫ്രീസ്-ഥോ സൈക്കിളുകൾ ഒഴിവാക്കുക.
പ്രോട്ടോക്കോൾ
【റീജൻ്റ് തയ്യാറാക്കൽ】
1. എല്ലാ റിയാക്ടറുകളും റഫ്രിജറേഷനിൽ നിന്ന് പുറത്തെടുത്ത് ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് മുറിയിലെ താപനിലയിലേക്ക് മടങ്ങാൻ അനുവദിക്കണം
(20° മുതൽ 25°C വരെ). ഉപയോഗത്തിന് ശേഷം ഉടൻ തന്നെ എല്ലാ റിയാക്ടറുകളും റഫ്രിജറേറ്ററിൽ സൂക്ഷിക്കുക.
2. എല്ലാ സാമ്പിളുകളും നിയന്ത്രണങ്ങളും ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് വോർട്ടെക്സ് ചെയ്യണം.
3. hACE2-HRP പരിഹാരം തയ്യാറാക്കൽ: hACE2-HRP സാന്ദ്രത 1: 51 നേർപ്പിക്കൽ അനുപാതത്തിൽ നേർപ്പിക്കുക
ബഫർ. ഉദാഹരണത്തിന്, 100 μL hACE2-HRP കോൺസെൻട്രേറ്റ് 5.0mL HRP ഡില്യൂഷൻ ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് നേർപ്പിക്കുക
ഒരു HACE2-HRP പരിഹാരം ഉണ്ടാക്കുക.
4. 1× വാഷ് സൊല്യൂഷൻ തയ്യാറാക്കൽ: 20× വാഷ് ലായനി ഡീയോണൈസ്ഡ് അല്ലെങ്കിൽ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളം ഉപയോഗിച്ച് നേർപ്പിക്കുക
വോളിയം അനുപാതം 1:19. ഉദാഹരണത്തിന്, 20 മില്ലി 20× വാഷ് സൊല്യൂഷൻ 380 മില്ലി ഡിയോണൈസ്ഡ് അല്ലെങ്കിൽ
400 മില്ലി 1× വാഷ് ലായനി ഉണ്ടാക്കാൻ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളം.
【ടെസ്റ്റ് നടപടിക്രമം】
1. പ്രത്യേക ട്യൂബുകളിൽ, തയ്യാറാക്കിയ hACE2-HRP സൊല്യൂഷൻ്റെ 120μL അലിഖോട്ട്.
2. ഓരോ ട്യൂബിലും 6 μL കാലിബ്രേറ്ററുകൾ, അജ്ഞാത സാമ്പിളുകൾ, ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണങ്ങൾ എന്നിവ ചേർത്ത് നന്നായി ഇളക്കുക.
3. ഘട്ടം 2-ൽ തയ്യാറാക്കിയ ഓരോ മിശ്രിതത്തിൻ്റെയും 100μL അനുബന്ധ മൈക്രോപ്ലേറ്റ് കിണറുകളിലേക്ക് മാറ്റുക
മുൻകൂട്ടി തയ്യാറാക്കിയ ടെസ്റ്റ് കോൺഫിഗറേഷനിലേക്ക്.
3. പ്ലേറ്റ് സീലർ ഉപയോഗിച്ച് പ്ലേറ്റ് മൂടി 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.
4. പ്ലേറ്റ് സീലർ നീക്കം ചെയ്ത് ഒരു കിണറിന് ഏകദേശം 300 μL 1× വാഷ് സൊല്യൂഷൻ ഉപയോഗിച്ച് പ്ലേറ്റ് നാല് തവണ കഴുകുക.
5. പടികൾ കഴുകിയ ശേഷം കിണറുകളിൽ അവശേഷിക്കുന്ന ദ്രാവകം നീക്കം ചെയ്യാൻ പേപ്പർ ടവലിൽ പ്ലേറ്റ് ടാപ്പുചെയ്യുക.
6. ഓരോ കിണറിലും 100 μL TMB ലായനി ചേർക്കുക, 20 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 20 - 25 ° C താപനിലയിൽ പ്ലേറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.
7. പ്രതികരണം നിർത്താൻ ഓരോ കിണറിലും 50 μL സ്റ്റോപ്പ് സൊല്യൂഷൻ ചേർക്കുക.
8. മൈക്രോപ്ലേറ്റ് റീഡറിലെ ആഗിരണം 10 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ 450 nm ൽ വായിക്കുക (അക്സസറിയായി 630nm ആണ്
ഉയർന്ന കൃത്യതയുള്ള പ്രകടനത്തിന് ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു).