Комплет за откривање на антитела за неутрализирање на SARS-COV-2 (ЕЛИСА)
【Принцип】
Комплетот за откривање на антитела за неутрализирачки антитела SARS-CoV-2 се заснова на конкурентна методологија на ЕЛИСА.
Користејќи го прочистениот домен за врзување на рецепторот (RBD), протеини од протеинот со вирусен шик (и) и клетката на домаќинот
рецептор ACE2, овој тест е дизајниран да ја имитира интеракцијата со неутрализирање на вирусот-домаќин.
Калибраторите, контролите на квалитетот и примероците од серум или плазма се индивидуално измешани во разредување
тампон што содржи hace2-hrp конјугат, кој се наоѓа во мали цевки. Тогаш се пренесуваат мешавините
бунарите за микрофлати кои содржат имобилизиран рекомбинантен фрагмент SARS-COV-2 RBD (RBD) за
инкубација. За време на 30-минутната инкубација, специфичното антитело на РБД во калибраторите, КК и
Примероците ќе се натпреваруваат со HACE2-HRP за специфично врзување на RBD имобилизираните во бунарите. По
Инкубацијата, бунарите се мијат 4 пати за да се отстрани неограничениот конјугат на HACE2-HRP. Решение на
TMB потоа се додава и се инкубира 20 минути на собна температура, што резултира во развој на a
сина боја. Развојот на бојата е запрен со додавање на 1N HCl, а апсорпцијата е
Измерено спектрофотометриски на 450 nm. Интензитетот на формираната боја е пропорционален со
Количината на ензим присутен и е обратно поврзан со количината на стандарди анализирани на ист начин.
Преку споредба со кривата на калибрација формирана од обезбедените калибратори, концентрацијата на
Потоа се пресметуваат неутрализирачки антитела во непознатиот примерок.
【Потребни материјали, но не се обезбедени】
1. дестилирана или деонизирана вода
2. Прецизни пипети: 10μL, 100μL, 200μL и 1 ml
3. Совети за пипета за еднократна употреба
4. Читател на микрофлати способен за читање на апсорпција на 450nm.
5. Абсорбента хартија
6. графичка хартија
7. вител миксер или еквивалент
【Собирање и складирање на примероци】
1. Серум и плазма примероци собрани во цевки што содржат K2-EDTA може да се користат за овој комплет.
2. Примероците треба да бидат опфатени и може да се чуваат до 48 часа на 2 ° C - 8 ° C пред да се испита.
Примероците што се чуваат подолго време (до 6 месеци) треба да бидат замрзнати само еднаш на -20 ° C пред анализата.
Избегнувајте повторени циклуси на замрзнување.
Протокол
【Подготовка на реагенс】
1. Сите реагенси мора да бидат извадени од ладење и да се дозволи да се вратат на собна температура пред употреба
(20 ° до 25 ° C). Зачувајте ги сите реагенси во фрижидер веднаш по употребата.
2. Сите примероци и контроли треба да бидат вртени пред употреба.
3. Подготовка на растворот HACE2-HRP: Разреден концентрат на HACE2-HRP на односот на разредување 1: 51 со разредување
Тампон. На пример, разредете 100 μL концентрат на HACE2-HRP со 5,0 ml тампон за разредување на HRP до
Направете решение HACE2-HRP.
Подготовка на растворот за миење 4. 1.
Сооднос на волумен од 1:19. На пример, разредете 20 ml од 20 × раствор за миење со 380 ml деонизиран или
Дестилирана вода за да се направи 400 ml раствор за миење 1 ×.
【Постапка за тестирање】
1. Во одделни цевки, аликут 120μl од подготвениот раствор HACE2-HRP.
2. Додадете 6 μl калибратори, непознати примероци, контроли на квалитет во секоја цевка и добро измешајте.
3. Пренесете 100μL од секоја мешавина подготвена во чекор 2 во соодветни бунари за микрофлати според
до претходно дизајнирана конфигурација на тестот.
3. Покријте ја плочата со заптивната плоча и инкубирајте на 37 ° C за 30 минути.
4. Извадете ја запечатувачот на плочата и измијте ја плочата со приближно 300 μl раствор за миење 1 × на добро за четири пати.
5. Допрете ја плочата на хартиена крпа за да ја отстраните преостанатата течност во бунарите по чекорите за перење.
6. Додадете 100 μl раствор на TMB на секој бунар и инкубирајте ја плочата во темно на 20 - 25 ° C за 20 минути.
7. Додадете 50 μl стоп раствор на секој бунар за да ја запрете реакцијата.
8 Прочитајте ја апсорпцијата во читач на микрофлати на 450 nm во рок од 10 минути (630nm како додаток е
се препорачува за поголема перформанси на прецизност).