Комплет за откривање антитела за неутрализирање SARS-CoV-2 (ELISA)
【ПРИНЦИП】
Комплетот за откривање антитела за неутрализирање SARS-CoV-2 се заснова на конкурентна методологија ELISA.
Користејќи прочистен домен за врзување на рецепторите (RBD), протеин од протеинот на вирусниот скок (S) и клетката домаќин
рецептор ACE2, овој тест е дизајниран да ја имитира интеракцијата на неутрализирање вирус-домаќин.
Калибраторите, контролите за квалитет и примероците од серум или плазма поединечно добро се мешаат во разредување
тампон кој содржи hACE2-HRP конјугат аликвотиран во мали епрувети.Потоа смесите се префрлаат во
бунарите на микроплочата што содржат имобилизиран рекомбинантен SARS-CoV-2 RBD фрагмент (RBD) за
инкубација.За време на 30-минутната инкубација, RBD специфичното антитело во калибраторите, QC и
примероците ќе се натпреваруваат со hACE2-HRP за специфично врзување на RBD имобилизиран во бунарите.По
за време на инкубацијата, бунарите се мијат 4 пати за да се отстрани неврзаниот конјугат hACE2-HRP.Решение на
Потоа се додава TMB и се инкубира 20 минути на собна температура, што резултира со развој на а
сина боја.Развојот на бојата се прекинува со додавање на 1N HCl, а апсорпцијата е
измерено спектрофотометриски на 450 nm.Интензитетот на формираната боја е пропорционален на
количеството на присутен ензим и е обратно поврзано со количината на стандарди испитани на ист начин.
Преку споредба со калибрационата крива формирана од обезбедените калибратори, концентрацијата на
потоа се пресметуваат неутрализирачките антитела во непознатиот примерок.
【ПОТРЕБНИ НО НЕ ОБЕЗБЕДЕНИ МАТЕРИЈАЛИ】
1. Дестилирана или дејонизирана вода
2. Прецизни пипети: 10μL, 100μL,200μL и 1 mL
3. Врвови за пипети за еднократна употреба
4. Читач на микроплоча способен да чита апсорпција на 450 nm.
5. Апсорбирачка хартија
6. Графикон хартија
7. Вител миксер или еквивалент
【СОБИРАЊЕ И ЧУВАЊЕ ПРИМЕРКИ】
1. За овој комплет може да се користат примероци од серум и плазма собрани во епрувети кои содржат K2-EDTA.
2. Примероците треба да бидат затворени и може да се чуваат до 48 часа на 2 °C - 8 °C пред анализата.
Примероците кои се чуваат подолго време (до 6 месеци) треба да се замрзнат само еднаш на -20 °C пред анализата.
Избегнувајте повторени циклуси на замрзнување-одмрзнување.
ПРОТОКОЛ
【Подготовка на реагенс】
1. Сите реагенси мора да се извадат од ладење и да се остават да се вратат на собна температура пред употреба
(20° до 25°C).Чувајте ги сите реагенси во фрижидер веднаш по употреба.
2. Сите примероци и контроли треба да се вртложат пред употреба.
3. hACE2-HRP Раствор Подготовка: Разредете го hACE2-HRP концентратот во разредување 1: 51 со разредување
Тампон.На пример, разредете 100 μL hACE2-HRP концентрат со 5,0 ml HRP разредувачки пуфер до
направи hACE2-HRP решение.
4. 1× Раствор за миење Подготовка: Разредете го 20× растворот за миење со дејонизирана или дестилирана вода со
сооднос на волумен од 1:19.На пример, разредете 20 мл 20 × раствор за миење со 380 мл дејонизиран или
дестилирана вода за да се направат 400 mL 1× раствор за миење.
【Процедура за тестирање】
1. Во посебни епрувети, издвојте 120 μL од подготвениот раствор на hACE2-HRP.
2. Додадете 6 μL калибратори, непознати примероци, контроли за квалитет во секоја епрувета и добро измешајте.
3. Префрлете 100 μL од секоја смеса подготвена во чекор 2 во соодветните бунари за микроплоча според
до претходно дизајнирана тест конфигурација.
3. Покријте ја плочата со Plate Sealer и инкубирајте на 37°C 30 минути.
4. Отстранете го заптивката на плочи и измијте ја плочата со приближно 300 μL 1× раствор за миење по бунар четири пати.
5. Допрете ја плочата на хартиена крпа за да ја отстраните преостанатата течност во бунарите по чекорите за миење.
6. Додадете 100 μL раствор на TMB во секоја бунар и инкубирајте ја плочата во темно на 20 - 25°C 20 минути.
7. Додадете 50 μL стоп раствор во секоја буна за да ја запрете реакцијата.
8. Прочитајте ја апсорпцијата во читачот на микроплоча на 450 nm во рок од 10 минути (630 nm како додаток е
се препорачува за перформанси со поголема прецизност).
