SARS-CoV-2 neitralizējošu antivielu noteikšanas komplekts (ELISA)
【PRINCIPS】
SARS-CoV-2 neitralizējošu antivielu noteikšanas komplekts ir balstīts uz konkurētspējīgu ELISA metodoloģiju.
Izmantojot attīrītu receptoru saistošo domēnu (RBD), proteīnu no vīrusa smaile (S) proteīna un saimniekšūnas
receptoru ACE2, šis tests ir izstrādāts, lai atdarinātu vīrusu un saimnieka neitralizējošu mijiedarbību.
Kalibratori, kvalitātes kontroles un seruma vai plazmas paraugi tiek atsevišķi labi sajaukti atšķaidījumā
buferšķīdums, kas satur hACE2-HRP konjugātu, kas sadalīts mazās mēģenēs. Pēc tam maisījumus pārnes
mikroplates iedobes, kas satur imobilizētu rekombinanto SARS-CoV-2 UBR fragmentu (RBD)
inkubācija. 30 minūšu inkubācijas laikā UBR specifiskā antiviela kalibratoros, QC un
paraugi konkurēs ar hACE2-HRP par specifisku saistīšanu ar iedobēs imobilizēto UBR. Pēc
Inkubācijas laikā iedobes mazgā 4 reizes, lai noņemtu nesaistīto hACE2-HRP konjugātu. Risinājums no
Pēc tam pievieno TMB un inkubē 20 minūtes istabas temperatūrā, kā rezultātā attīstās a
zila krāsa. Krāsas attīstība tiek apturēta, pievienojot 1N HCl, un absorbcija ir
mēra spektrofotometriski pie 450 nm. Veidotās krāsas intensitāte ir proporcionāla
enzīma daudzumu, un tas ir apgriezti saistīts ar tādā pašā veidā pārbaudīto standartu daudzumu.
Salīdzinot ar kalibrēšanas līkni, ko veido nodrošinātie kalibratori, koncentrācija
Pēc tam aprēķina neitralizējošās antivielas nezināmajā paraugā.
【NEPIECIEŠAMI MATERIĀLI, BET NAV NODROŠINĀTI】
1. Destilēts vai dejonizēts ūdens
2. Precīzas pipetes: 10 μL, 100 μL, 200 μL un 1 ml
3. Vienreizējās lietošanas pipetes uzgaļi
4. Mikroplašu lasītājs, kas spēj nolasīt absorbciju pie 450 nm.
5. Absorbējošs papīrs
6. Grafiku papīrs
7. Vortex maisītājs vai līdzvērtīgs
【PARAUGU VĀKŠANA UN UZGLABĀŠANA】
1. Šim komplektam var izmantot seruma un plazmas paraugus, kas savākti mēģenēs, kas satur K2-EDTA.
2. Paraugi ir jāaizver, un pirms analīzes tos var uzglabāt līdz 48 stundām 2 °C – 8 °C temperatūrā.
Paraugus, kas turēti ilgāku laiku (līdz 6 mēnešiem), pirms testa drīkst sasaldēt tikai vienu reizi -20 °C.
Izvairieties no atkārtotiem sasaldēšanas-atkausēšanas cikliem.
PROTOKOLS
【Reaģenta sagatavošana】
1. Pirms lietošanas visi reaģenti ir jāizņem no ledusskapja un jāļauj tiem atgriezties istabas temperatūrā
(20° līdz 25°C). Nekavējoties pēc lietošanas visus reaģentus uzglabājiet ledusskapī.
2. Pirms lietošanas visi paraugi un kontroles ir jāsamaisa ar vorteksu.
3. hACE2-HRP šķīduma pagatavošana: atšķaidiet hACE2-HRP koncentrātu ar atšķaidīšanas attiecību 1:51
Buferis. Piemēram, atšķaidiet 100 μL hACE2-HRP koncentrāta ar 5,0 ml HRP atšķaidīšanas buferšķīduma, lai
izveidojiet hACE2-HRP šķīdumu.
4. 1 × mazgāšanas šķīduma sagatavošana: atšķaidiet 20 × mazgāšanas šķīdumu ar dejonizētu vai destilētu ūdeni ar
tilpuma attiecība 1:19. Piemēram, atšķaida 20 ml 20x mazgāšanas šķīduma ar 380 ml dejonizēta vai
destilētu ūdeni, lai pagatavotu 400 ml 1 × mazgāšanas šķīduma.
【Pārbaudes procedūra】
1. Atsevišķās mēģenēs izdaliet 120 μL sagatavotā hACE2-HRP šķīduma.
2. Katrā mēģenē pievienojiet 6 μL kalibratoru, nezināmus paraugus, kvalitātes kontroles un labi samaisiet.
3. Ievietojiet 100 μL katra maisījuma, kas sagatavots 2. solī, attiecīgajās mikroplates iedobēs saskaņā ar
uz iepriekš izstrādātu testa konfigurāciju.
3. Pārklājiet plāksni ar Plate Sealer un inkubējiet 37°C 30 minūtes.
4. Noņemiet plāksnīšu blīvētāju un četras reizes mazgājiet plāksni ar aptuveni 300 μL 1 × mazgāšanas šķīduma katrā iedobē.
5. Uzsitiet plāksni uz papīra dvieļa, lai pēc mazgāšanas soļiem iedobēs noņemtu atlikušo šķidrumu.
6. Katrai iedobei pievienojiet 100 μL TMB šķīduma un 20 minūtes inkubējiet plāksni tumsā 20–25°C temperatūrā.
7. Katrai iedobei pievienojiet 50 μL apturēšanas šķīduma, lai apturētu reakciju.
8. Nolasiet absorbciju mikroplašu lasītājā pie 450 nm 10 minūšu laikā (630 nm kā piederums
ieteicams augstākai veiktspējai).