SARS-CoV-2 neutralizuojančių antikūnų aptikimo rinkinys (ELISA)
【PRINCIPAS】
SARS-CoV-2 neutralizuojančių antikūnų aptikimo rinkinys yra pagrįstas konkurencinga ELISA metodika.
Naudojant išgrynintą receptorių surišimo domeną (RBD), baltymą iš viruso smaigalio (S) baltymo ir ląstelės šeimininkės
ACE2 receptorių, šis testas skirtas imituoti viruso ir šeimininko neutralizuojančią sąveiką.
Kalibratoriai, kokybės kontrolė ir serumo arba plazmos mėginiai atskirai gerai sumaišomi praskiedus
buferis, kuriame yra hACE2-HRP konjugato, padalytas į mažus mėgintuvėlius.Tada mišiniai supilami
mikroplokštelės šulinėliai, kuriuose yra imobilizuotas rekombinantinis SARS-CoV-2 UBR fragmentas (RBD)
inkubacija.30 minučių inkubacijos metu UBR specifinis antikūnas kalibratoriuose, QC ir
mėginiai konkuruos su hACE2-HRP dėl specifinio UBR surišimo, imobilizuoto šuliniuose.Po to
Inkubuojant, šuliniai plaunami 4 kartus, kad būtų pašalintas nesusijungęs hACE2-HRP konjugatas.Sprendimas dėl
Tada pridedama TMB ir inkubuojama 20 minučių kambario temperatūroje, todėl susidaro a
mėlyna spalva.Spalvos vystymasis sustabdomas pridedant 1N HCl, o absorbcija yra
išmatuotas spektrofotometriškai esant 450 nm.Susidariusios spalvos intensyvumas yra proporcingas
fermento kiekis ir yra atvirkščiai susijęs su tokiu pačiu būdu ištirtų etalonų kiekiu.
Palyginus su pateiktų kalibratorių suformuota kalibravimo kreive, koncentracija
tada apskaičiuojamas neutralizuojančių antikūnų kiekis nežinomame mėginyje.
【REIKALINGOS MEDŽIAGOS, BET NEPATEIKIAMOS】
1. Distiliuotas arba dejonizuotas vanduo
2. Tikslios pipetės: 10 μL, 100 μL, 200 μL ir 1 mL
3. Vienkartiniai pipetės antgaliai
4. Mikroplokštelių skaitytuvas, galintis nuskaityti absorbciją esant 450 nm.
5. Sugeriantis popierius
6. Grafinis popierius
7. Vortex maišytuvas arba lygiavertis
【MĖGINIŲ ĖMIMAS IR SANDĖLIAVIMAS】
1. Šiam rinkiniui gali būti naudojami serumo ir plazmos mėginiai, surinkti mėgintuvėliuose, kuriuose yra K2-EDTA.
2. Mėginiai turi būti uždengti ir prieš tyrimą gali būti laikomi iki 48 valandų 2 °C – 8 °C temperatūroje.
Mėginiai, laikomi ilgesnį laiką (iki 6 mėnesių), prieš tyrimą turi būti užšaldyti tik vieną kartą -20 °C temperatūroje.
Venkite pasikartojančių užšaldymo ir atšildymo ciklų.
PROTOKOLAS
【Reagento paruošimas】
1. Prieš naudojimą visi reagentai turi būti išimti iš šaldytuvo ir leisti sušilti iki kambario temperatūros
(nuo 20° iki 25°C).Panaudoję visus reagentus nedelsdami laikykite šaldytuve.
2. Prieš naudojant visus mėginius ir kontrolinius bandinius reikia sumaišyti.
3. hACE2-HRP tirpalo paruošimas: praskieskite hACE2-HRP koncentratą 1:51 praskiedimo santykiu su skiedimu
Buferis.Pavyzdžiui, praskieskite 100 μL hACE2-HRP koncentrato su 5,0 ml HRP skiedimo buferio, kad
padaryti hACE2-HRP tirpalą.
4. 1 × plovimo tirpalo paruošimas: praskieskite 20 × plovimo tirpalą dejonizuotu arba distiliuotu vandeniu
tūrio santykis 1:19.Pavyzdžiui, atskieskite 20 ml 20 × plovimo tirpalo su 380 ml dejonizuoto arba
distiliuoto vandens, kad gautumėte 400 ml 1 × plovimo tirpalo.
【Bandymo procedūra】
1. Į atskirus mėgintuvėlius paskirstykite 120 μL paruošto hACE2-HRP tirpalo.
2. Į kiekvieną mėgintuvėlį įpilkite 6 μL kalibratorių, nežinomų mėginių, kokybės kontrolės ir gerai išmaišykite.
3. Perpilkite 100 μl kiekvieno 2 veiksme paruošto mišinio į atitinkamas mikroplokštelės šulinėles pagal
į iš anksto sukurtą bandymo konfigūraciją.
3. Uždenkite plokštelę Plokštės sandarikliu ir inkubuokite 37 °C temperatūroje 30 minučių.
4. Nuimkite plokštelės sandariklį ir keturis kartus plaukite plokštelę maždaug 300 μL 1 × plovimo tirpalo viename šulinyje.
5. Bakstelėkite lėkštę į popierinį rankšluostį, kad po plovimo šuliniuose pašalintumėte skysčio likučius.
6. Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 100 μL TMB tirpalo ir 20 minučių inkubuokite plokštelę tamsoje 20–25°C temperatūroje.
7. Reakcijai sustabdyti į kiekvieną šulinėlį įpilkite 50 μL stabdymo tirpalo.
8. Nuskaitykite absorbciją mikroplokštelių skaitytuve esant 450 nm per 10 minučių (630 nm kaip priedas
rekomenduojama siekiant didesnio tikslumo).
