ຊຸດກວດຫາ Antibody Neutralizing SARS-CoV-2 (ELISA)
【ຫຼັກການ】
ຊຸດກວດຫາ Antibody Neutralizing SARS-CoV-2 ແມ່ນອີງໃສ່ວິທີການແຂ່ງຂັນ ELISA.
ການນໍາໃຊ້ purified receptor binding domain (RBD), ທາດໂປຼຕີນຈາກ viral spike (S) protein ແລະຈຸລັງເຈົ້າພາບ
receptor ACE2, ການທົດສອບນີ້ໄດ້ຖືກອອກແບບເພື່ອ mimic ການໂຕ້ຕອບທີ່ເປັນກາງຂອງເຊື້ອໄວຣັສ host.
Calibrators, ການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບ, ແລະຕົວຢ່າງ serum ຫຼື plasma ແມ່ນປະສົມສ່ວນບຸກຄົນຢ່າງດີໃນການເຈືອຈາງ.
buffer ທີ່ບັນຈຸ hACE2-HRP conjugate aliquoted ໃນທໍ່ຂະຫນາດນ້ອຍ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ການປະສົມໄດ້ຖືກໂອນເຂົ້າ
ຂຸມ microplate ທີ່ບັນຈຸ SARS-CoV-2 RBD fragment (RBD) immobilized recombinant
incubation.ໃນລະຫວ່າງການ incubation 30 ນາທີ, ພູມຕ້ານທານສະເພາະ RBD ໃນ calibrators, QC ແລະ.
ຕົວຢ່າງຈະແຂ່ງຂັນກັບ hACE2-HRP ສໍາລັບການຜູກມັດສະເພາະ RBD immobilized ໃນນ້ໍາດີ.ຫຼັງຈາກ
incubation ໄດ້, ນ້ໍາດີໄດ້ຖືກລ້າງ 4 ເທື່ອເພື່ອເອົາ unbound hACE2-HRP conjugate.ການແກ້ໄຂຂອງ
ຫຼັງຈາກນັ້ນ, TMB ໄດ້ຖືກເພີ່ມແລະ incubated ສໍາລັບ 20 ນາທີຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ, ຜົນອອກມາໃນການພັດທະນາຂອງ a
ສີຟ້າ.ການພັດທະນາສີແມ່ນຢຸດເຊົາດ້ວຍການເພີ່ມ 1N HCl, ແລະການດູດຊຶມແມ່ນ
ການວັດແທກ spectrophotometrically ຢູ່ 450 nm.ຄວາມເຂັ້ມຂອງສີທີ່ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນແມ່ນອັດຕາສ່ວນກັບ
ປະລິມານຂອງ enzyme ໃນປະຈຸບັນ, ແລະມີຄວາມກ່ຽວຂ້ອງກັນກັບປະລິມານຂອງມາດຕະຖານທີ່ຖືກປະເມີນໃນທາງດຽວກັນ.
ຜ່ານການສົມທຽບກັບເສັ້ນໂຄ້ງການປັບປະກອບດ້ວຍການປັບທຽບສະຫນອງໃຫ້, ຄວາມເຂັ້ມແຂງຂອງ
ຈາກນັ້ນການຄິດໄລ່ພູມຕ້ານທານ neutralizing ໃນຕົວຢ່າງທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກແມ່ນໄດ້ຖືກຄິດໄລ່.
【ວັດສະດຸທີ່ຕ້ອງການແຕ່ບໍ່ໄດ້ໃຫ້】
1. ນ້ໍາກັ່ນຫຼື deionized
2. ທໍ່ຄວາມຊັດເຈນ: 10μL, 100μL, 200μL ແລະ 1 mL
3. ຄໍາແນະນໍາ pipette ຖິ້ມ
4. ເຄື່ອງອ່ານ Microplate ສາມາດອ່ານການດູດຊຶມຢູ່ທີ່ 450nm.
5. ເຈ້ຍດູດຊຶມ
6. ເຈ້ຍກາບ
7. ເຄື່ອງປະສົມ Vortex ຫຼືທຽບເທົ່າ
【ການເກັບຕົວຢ່າງແລະການເກັບຮັກສາ】
1. ຕົວຢ່າງ Serum ແລະ Plasma ທີ່ເກັບຢູ່ໃນທໍ່ທີ່ມີ K2-EDTA ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບຊຸດນີ້.
2. ຕົວຢ່າງຄວນຖືກຫຸ້ມໄວ້ ແລະ ອາດຈະເກັບຮັກສາໄວ້ໄດ້ດົນເຖິງ 48 ຊົ່ວໂມງ ຢູ່ທີ່ 2 °C - 8 °C ກ່ອນການປະເມີນ.
ຕົວຢ່າງທີ່ເກັບຮັກສາໄວ້ເປັນເວລາດົນກວ່າ (ເຖິງ 6 ເດືອນ) ຄວນຖືກແຊ່ແຂງພຽງຄັ້ງດຽວທີ່ອຸນຫະພູມ -20 °C ກ່ອນທີ່ຈະກວດສອບ.
ຫຼີກລ້ຽງຮອບວຽນການແຊ່ແຂງຊ້ຳໆ.
ພິທີການ
【ການກະກຽມ Reagent】
1. ທຸກ reagents ຕ້ອງໄດ້ຖືກເອົາອອກຈາກຕູ້ເຢັນແລະອະນຸຍາດໃຫ້ກັບຄືນສູ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້
(20° ຫາ 25°C).ບັນທຶກທາດ reagents ທັງໝົດໄວ້ໃນຕູ້ເຢັນທັນທີຫຼັງຈາກໃຊ້.
2. ຕົວຢ່າງແລະການຄວບຄຸມທັງຫມົດຄວນໄດ້ຮັບການ vortexed ກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້.
3. ການກະກຽມການແກ້ໄຂ hACE2-HRP: ເຈືອຈາງ hACE2-HRP ເຂັ້ມຂຸ້ນໃນອັດຕາສ່ວນ 1: 51 dilution ກັບ Dilution.
ບັກ.ຕົວຢ່າງ, ເຈືອຈາງ 100 μL ຂອງ hACE2-HRP ເຂັ້ມຂຸ້ນດ້ວຍ 5.0mL ຂອງ HRP Dilution Buffer ເພື່ອ
ເຮັດການແກ້ໄຂ hACE2-HRP.
4. 1 × ການກະກຽມການແກ້ໄຂ: ເຈືອຈາງການແກ້ໄຂ 20 × ລ້າງດ້ວຍນ້ໍາ deionized ຫຼືກັ່ນດ້ວຍນ້ໍາ.
ອັດຕາສ່ວນປະລິມານ 1:19.ຕົວຢ່າງ, ເຈືອຈາງ 20 mL ຂອງ 20 × Wash Solution ດ້ວຍ 380 mL ຂອງ deionized ຫຼື.
ນ້ໍາກັ່ນເພື່ອເຮັດໃຫ້ 400 ມລຂອງການແກ້ໄຂ 1 × ລ້າງ.
【ຂັ້ນຕອນການທົດສອບ】
1. ໃນທໍ່ແຍກຕ່າງຫາກ, aliquot 120μLຂອງການແກ້ໄຂ hACE2-HRP ກະກຽມ.
2. ເພີ່ມ 6 μLຂອງ calibrators, ຕົວຢ່າງທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກ, ການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບໃນແຕ່ລະທໍ່ແລະປະສົມກັນ.
3. ໂອນ 100μL ຂອງແຕ່ລະປະສົມທີ່ກະກຽມໃນຂັ້ນຕອນທີ 2 ເຂົ້າໄປໃນຂຸມ microplate ທີ່ສອດຄ້ອງກັນຕາມ.
ກັບການຕັ້ງຄ່າການທົດສອບທີ່ອອກແບບມາ.
3. ກວມເອົາແຜ່ນດ້ວຍ Plate Sealer ແລະ incubate ຢູ່ທີ່ 37 ° C ເປັນເວລາ 30 ນາທີ.
4. ເອົາ Plate Sealer ແລະລ້າງຈານດ້ວຍນ້ໍາປະມານ 300 μL ຂອງ 1 × Wash Solution ຕໍ່ wellfor ສີ່ຄັ້ງ.
5. ແຕະແຜ່ນໃສ່ຜ້າເຊັດເຈ້ຍເພື່ອເອົາຂອງແຫຼວທີ່ຕົກຄ້າງຢູ່ໃນນໍ້າສ້າງຫຼັງຈາກຂັ້ນຕອນການລ້າງ.
6. ຕື່ມ 100 μL ຂອງ TMB Solution ໃສ່ແຕ່ລະຂຸມແລະ incubate ແຜ່ນໃນຄວາມມືດທີ່ 20 - 25 ° C ສໍາລັບ 20 ນາທີ.
7. ຕື່ມ 50 μLຂອງ Stop Solution ໃສ່ແຕ່ລະດີເພື່ອຢຸດຕິກິຣິຍາ.
8. ອ່ານການດູດຊຶມໃນ microplate reader ທີ່ 450 nm ພາຍໃນ 10 ນາທີ (630nm ເປັນອຸປະກອນເສີມແມ່ນ.
ແນະນໍາໃຫ້ສໍາລັບການປະຕິບັດຄວາມແມ່ນຍໍາສູງ).
