SARS-CoV-2 нейтралдаштыруучу антителолорду аныктоо комплекти (ELISA)
【ПРИНЦИП】
SARS-CoV-2 нейтралдаштыруучу антителолорду аныктоо комплекти ELISA атаандаштык методологиясына негизделген.
Тазаланган рецептордук байланыш доменин (RBD), вирустук спике (S) протеининен жана кабыл алуучу клеткадан протеинди колдонуу
ACE2 рецептору, бул тест вирус-хосттун нейтралдаштыруучу өз ара аракеттенүүсүн тууроо үчүн иштелип чыккан.
Калибраторлор, Сапатты көзөмөлдөө каражаттары жана сыворотка же плазма үлгүлөрү суюлтууда жакшылап аралаштырылат
кичинекей түтүкчөлөргө бөлүнгөн hACE2-HRP конъюгаты камтыган буфер. Андан кийин аралашмалар которулат
үчүн иммобилизацияланган рекомбинантты SARS-CoV-2 RBD фрагментин (RBD) камтыган микропластиналык кудуктар
инкубациялоо. 30 мүнөттүк инкубация учурунда калибраторлордогу RBD спецификалык антитело, QC жана
үлгүлөр скважиналарда иммобилизацияланган RBDди өзгөчө байланыштыруу үчүн hACE2-HRP менен атаандашат. Кийин
инкубациялоодо, скважиналар байланышпаган hACE2-HRP конъюгатын алып салуу үчүн 4 жолу жуулат. бир чечим
Андан кийин ТМБ кошулат жана бөлмө температурасында 20 мүнөт инкубацияланат, натыйжада а
көк түс. Түстүн өнүгүшү 1N HCl кошулуусу менен токтотулуп, абсорбенция болот
спектрофотометрикалык 450 нм боюнча өлчөнгөн. Түзүлгөн түстүн интенсивдүүлүгү пропорционалдуу
ферменттин саны жана ошол эле жол менен анализденген стандарттардын санына тескери байланыштуу.
Берилген калибраторлор тарабынан түзүлгөн калибрлөө ийри сызыгы менен салыштыруу аркылуу концентрация
анда белгисиз үлгүдөгү нейтралдаштыруучу антителолор эсептелет.
【ТАЛАП КЫЛГАН МАТЕРИАЛДАР БИРОК БЕРИЛБЕЙТ】
1. Дистилденген же деионизацияланган суу
2. Так пипеткалар: 10μL, 100μL, 200μL жана 1 мл
3. Бир жолу колдонулуучу пипеткалардын учтары
4. 450nm абсорбенцияны окууга жөндөмдүү микропластинаны окугуч.
5. соргуч кагаз
6. Графикалык кагаз
7. Vortex аралаштыргыч же эквиваленти
【УЛГОНДУ ЖОГОО ЖАНА САКТОО】
1. Бул комплект үчүн K2-EDTA камтыган түтүкчөлөргө чогултулган сыворотка жана плазма үлгүлөрү колдонулушу мүмкүн.
2. Үлгүлөр жабылышы керек жана анализ жүргүзүүнүн алдында 2 °C - 8 °C температурада 48 саатка чейин сакталышы керек.
Узак мөөнөткө (6 айга чейин) сакталган үлгүлөрдү анализге чейин -20 °C температурада бир гана жолу тоңдуруп салуу керек.
Кайталануучу тоңдуруу-эрүү циклдарынан алыс болуңуз.
ПРОТОКОЛ
【Реагент даярдоо】
1. Бардык реагенттерди муздаткычтан алып чыгып, колдонуудан мурун бөлмө температурасына кайтаруу керек
(20°тан 25°Сге чейин). Бардык реагенттерди колдонгондон кийин дароо муздаткычта сактаңыз.
2. Бардык үлгүлөр жана контролдоо каражаттары колдонуудан мурун vortexed болушу керек.
3. hACE2-HRP эритмесин даярдоо: hACE2-HRP концентратын 1:51 суюлтуу катышы менен суюлтуңуз
буфер. Мисалы, 100 мкл hACE2-HRP концентратын 5,0 мл HRP суюлтуу буфери менен суюлтуңуз.
hACE2-HRP чечим чыгаруу.
4. 1× Жуучу эритмени даярдоо: 20× Жуучу эритмени деионизацияланган же дистилденген суу менен эритиңиз.
көлөмүнүн катышы 1:19. Мисалы, 20 мл 20 × жуу эритмесин 380 мл деионизацияланган же
дистилденген суудан 400 мл 1 × Жуу эритмеси.
【Сыноо процедурасы】
1. Өзүнчө түтүкчөлөргө даярдалган hACE2-HRP эритмесинен 120 мкл аликвот.
2. Ар бир түтүккө 6 мкл калибраторлорду, белгисиз үлгүлөрдү, сапатты көзөмөлдөөнү кошуп, жакшылап аралаштырыңыз.
3. 2-кадамда даярдалган ар бир аралашмадан 100 мклди микропластинанын тиешелүү скважиналарына өткөрүңүз.
алдын ала иштелип чыккан сыноо конфигурациясына.
3. Пластинаны пластина жабуучу менен жаап, 37°C температурада 30 мүнөт инкубациялаңыз.
4. Пластина жапкычты алып, пластинканы болжол менен 300 мкл 1× Жуу эритмеси менен ар бир кудукка төрт жолу жуу.
5. Жуу кадамдарынан кийин скважиналардагы калдык суюктуктарды кетирүү үчүн табакчаны кагаз сүлгүгө таптаңыз.
6. Ар бир кудукка 100 мкл TMB эритмесин кошуп, пластинканы караңгы жерде 20 - 25°C температурада 20 мүнөт инкубациялаңыз.
7. Реакцияны токтотуу үчүн ар бир көзөнөккө 50 мкл Stop Solution кошуңуз.
8. Микропластинаны окугучта 450 нмде 10 мүнөттүн ичинде абсорбенцияны окуңуз (кошумча катары 630 нм
жогорку тактык үчүн сунушталат).