SARS-CoV-2 ತಟಸ್ಥಗೊಳಿಸುವ ಪ್ರತಿಕಾಯ ಪತ್ತೆ ಕಿಟ್ (ELISA)
【ತತ್ವ】
SARS-CoV-2 ನ್ಯೂಟ್ರಲೈಸಿಂಗ್ ಆಂಟಿಬಾಡಿ ಡಿಟೆಕ್ಷನ್ ಕಿಟ್ ಸ್ಪರ್ಧಾತ್ಮಕ ELISA ವಿಧಾನವನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ.
ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ರಿಸೆಪ್ಟರ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಡೊಮೇನ್ (RBD) ಅನ್ನು ಬಳಸುವುದು, ವೈರಲ್ ಸ್ಪೈಕ್ (S) ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮತ್ತು ಹೋಸ್ಟ್ ಸೆಲ್‌ನಿಂದ ಪ್ರೋಟೀನ್
ಗ್ರಾಹಕ ACE2, ಈ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ವೈರಸ್-ಹೋಸ್ಟ್ ತಟಸ್ಥಗೊಳಿಸುವ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಅನುಕರಿಸಲು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಕ್ಯಾಲಿಬ್ರೇಟರ್‌ಗಳು, ಗುಣಮಟ್ಟ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳು ಮತ್ತು ಸೀರಮ್ ಅಥವಾ ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಚೆನ್ನಾಗಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ
hACE2-HRP ಸಂಯೋಜಕವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಬಫರ್ ಸಣ್ಣ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅಲಿಕೋಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ನಂತರ ಮಿಶ್ರಣಗಳನ್ನು ಒಳಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ
ನಿಶ್ಚಲವಾದ ಮರುಸಂಯೋಜಕ SARS-CoV-2 RBD ತುಣುಕನ್ನು (RBD) ಹೊಂದಿರುವ ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೇಟ್ ಬಾವಿಗಳು
ಕಾವು. 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾವು ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಕ್ಯಾಲಿಬ್ರೇಟರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ RBD ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರತಿಕಾಯ, QC ಮತ್ತು
ಬಾವಿಗಳಲ್ಲಿ ನಿಶ್ಚಲವಾಗಿರುವ RBD ಅನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಬಂಧಿಸಲು ಮಾದರಿಗಳು hACE2-HRP ಯೊಂದಿಗೆ ಸ್ಪರ್ಧಿಸುತ್ತವೆ. ನಂತರ
ಕಾವು, ಅನ್ಬೌಂಡ್ hACE2-HRP ಸಂಯೋಗವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಬಾವಿಗಳನ್ನು 4 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಒಂದು ಪರಿಹಾರ
ನಂತರ TMB ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ a
ನೀಲಿ ಬಣ್ಣ. 1N HCl ಸೇರ್ಪಡೆಯೊಂದಿಗೆ ಬಣ್ಣ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯನ್ನು ನಿಲ್ಲಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆ
450 nm ನಲ್ಲಿ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೆಟ್ರಿಕ್‌ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ರೂಪುಗೊಂಡ ಬಣ್ಣದ ತೀವ್ರತೆಯು ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿರುತ್ತದೆ
ಪ್ರಸ್ತುತ ಇರುವ ಕಿಣ್ವದ ಪ್ರಮಾಣ, ಮತ್ತು ಅದೇ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲಾದ ಮಾನದಂಡಗಳ ಪ್ರಮಾಣಕ್ಕೆ ವಿಲೋಮವಾಗಿ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ.
ಒದಗಿಸಿದ ಕ್ಯಾಲಿಬ್ರೇಟರ್‌ಗಳಿಂದ ರೂಪುಗೊಂಡ ಮಾಪನಾಂಕ ನಿರ್ಣಯದ ರೇಖೆಯೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಕೆಯ ಮೂಲಕ, ಸಾಂದ್ರತೆಯು
ನಂತರ ಅಜ್ಞಾತ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ತಟಸ್ಥಗೊಳಿಸುವ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.
【ಮೆಟೀರಿಯಲ್ಸ್ ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಆದರೆ ಒದಗಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ】
1. ಬಟ್ಟಿ ಇಳಿಸಿದ ಅಥವಾ ಅಯಾನೀಕರಿಸಿದ ನೀರು
2. ನಿಖರ ಪೈಪೆಟ್‌ಗಳು: 10μL, 100μL,200μL ಮತ್ತು 1 mL
3. ಬಿಸಾಡಬಹುದಾದ ಪೈಪೆಟ್ ಸಲಹೆಗಳು
4. ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೇಟ್ ರೀಡರ್ 450nm ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಓದುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.
5. ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಕಾಗದ
6. ಗ್ರಾಫ್ ಪೇಪರ್
7. ವೋರ್ಟೆಕ್ಸ್ ಮಿಕ್ಸರ್ ಅಥವಾ ಸಮಾನ
【ಮಾದರಿ ಸಂಗ್ರಹಣೆ ಮತ್ತು ಸಂಗ್ರಹಣೆ】
1. K2-EDTA ಹೊಂದಿರುವ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದ ಸೀರಮ್ ಮತ್ತು ಪ್ಲಾಸ್ಮಾ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಈ ಕಿಟ್‌ಗೆ ಬಳಸಬಹುದು.
2. ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಮುಚ್ಚಬೇಕು ಮತ್ತು ಪರೀಕ್ಷೆಗೆ ಮುಂಚಿತವಾಗಿ 2 °C - 8 °C ನಲ್ಲಿ 48 ಗಂಟೆಗಳವರೆಗೆ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬಹುದು.
ದೀರ್ಘಾವಧಿಯವರೆಗೆ (6 ತಿಂಗಳವರೆಗೆ) ಹಿಡಿದಿಟ್ಟುಕೊಳ್ಳುವ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಮೊದಲು -20 °C ನಲ್ಲಿ ಒಮ್ಮೆ ಮಾತ್ರ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಬೇಕು.
ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಫ್ರೀಜ್-ಲೇಪ ಚಕ್ರಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ.
ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್
【ಕಾರಕ ತಯಾರಿ】
1. ಎಲ್ಲಾ ಕಾರಕಗಳನ್ನು ಶೈತ್ಯೀಕರಣದಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಬೇಕು ಮತ್ತು ಬಳಕೆಗೆ ಮೊದಲು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶಕ್ಕೆ ಮರಳಲು ಅನುಮತಿಸಬೇಕು
(20° ರಿಂದ 25°C). ಬಳಕೆಯ ನಂತರ ತಕ್ಷಣವೇ ರೆಫ್ರಿಜರೇಟರ್ನಲ್ಲಿ ಎಲ್ಲಾ ಕಾರಕಗಳನ್ನು ಉಳಿಸಿ.
2. ಎಲ್ಲಾ ಮಾದರಿಗಳು ಮತ್ತು ನಿಯಂತ್ರಣಗಳನ್ನು ಬಳಸುವ ಮೊದಲು ಸುಳಿಯಬೇಕು.
3. hACE2-HRP ಪರಿಹಾರ ತಯಾರಿಕೆ: ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ 1: 51 ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ hACE2-HRP ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ
ಬಫರ್. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, 5.0mL HRP ಡೈಲ್ಯೂಷನ್ ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ 100 μL hACE2-HRP ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ
HACE2-HRP ಪರಿಹಾರವನ್ನು ಮಾಡಿ.
4. 1× ವಾಶ್ ಪರಿಹಾರ ತಯಾರಿಕೆ: 20× ವಾಶ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಡಿಯೋನೈಸ್ಡ್ ಅಥವಾ ಡಿಸ್ಟಿಲ್ಡ್ ವಾಟರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ
ಪರಿಮಾಣ ಅನುಪಾತ 1:19. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, 20 ಮಿಲಿ 20× ವಾಶ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು 380 ಎಂಎಲ್ ಡಿಯೋನೈಸ್ಡ್ ಅಥವಾ
400 ಮಿಲಿ 1× ವಾಶ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಮಾಡಲು ಬಟ್ಟಿ ಇಳಿಸಿದ ನೀರು.
【ಪರೀಕ್ಷಾ ವಿಧಾನ】
1. ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳಲ್ಲಿ, ತಯಾರಾದ hACE2-HRP ಪರಿಹಾರದ 120μL ಆಲ್ಕೋಟ್.
2. ಪ್ರತಿ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ 6 μL ಕ್ಯಾಲಿಬ್ರೇಟರ್‌ಗಳು, ಅಜ್ಞಾತ ಮಾದರಿಗಳು, ಗುಣಮಟ್ಟದ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಚೆನ್ನಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ.
3. ಹಂತ 2 ರಲ್ಲಿ ತಯಾರಿಸಲಾದ ಪ್ರತಿ ಮಿಶ್ರಣದ 100μL ಅನ್ನು ಅನುಗುಣವಾದ ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೇಟ್ ಬಾವಿಗಳಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ
ಪೂರ್ವವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿದ ಪರೀಕ್ಷಾ ಸಂರಚನೆಗೆ.
3. ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಪ್ಲೇಟ್ ಸೀಲರ್ನೊಂದಿಗೆ ಕವರ್ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು 37 ° C ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಿ.
4. ಪ್ಲೇಟ್ ಸೀಲರ್ ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ ಸರಿಸುಮಾರು 300 μL 1× ವಾಶ್ ಪರಿಹಾರದೊಂದಿಗೆ ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ನಾಲ್ಕು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಿರಿ.
5. ತೊಳೆಯುವ ಹಂತಗಳ ನಂತರ ಬಾವಿಗಳಲ್ಲಿ ಉಳಿದಿರುವ ದ್ರವವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಪೇಪರ್ ಟವೆಲ್ ಮೇಲೆ ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಟ್ಯಾಪ್ ಮಾಡಿ.
6. ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ 100 μL TMB ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 20 - 25 ° C ನಲ್ಲಿ ಕತ್ತಲೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಕಾವುಕೊಡಿ.
7. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿಲ್ಲಿಸಲು ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ 50 μL ಸ್ಟಾಪ್ ಪರಿಹಾರವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ.
8. ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೇಟ್ ರೀಡರ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು 450 nm ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ ಓದಿ (630nm ಆನುಷಂಗಿಕವಾಗಿದೆ
ಹೆಚ್ಚಿನ ನಿಖರ ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆಗಾಗಿ ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ).