SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit (ELISA)
【គោលការណ៍】
កញ្ចប់ឧបករណ៍រកឃើញអង្គបដិប្រាណអព្យាក្រឹត SARS-CoV-2 គឺផ្អែកលើវិធីសាស្ត្រ ELISA ប្រកួតប្រជែង។
ដោយប្រើ purified receptor binding domain (RBD) ប្រូតេអ៊ីនពីប្រូតេអ៊ីនមេរោគ (S) និងកោសិកាម៉ាស៊ីន
អ្នកទទួល ACE2 ការធ្វើតេស្តនេះត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីធ្វើត្រាប់តាមអន្តរកម្មអព្យាក្រឹតនៃមេរោគ។
ឧបករណ៍ក្រិតតាមខ្នាត ការត្រួតពិនិត្យគុណភាព និងសំណាកសេរ៉ូម ឬប្លាស្មាត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងល្អនៅក្នុងការរំលាយ
សតិបណ្ដោះអាសន្នដែលមាន hACE2-HRP conjugate aliquoted ក្នុងបំពង់តូច។បន្ទាប់មកល្បាយត្រូវបានផ្ទេរចូល
អណ្តូងមីក្រូប្លាតដែលមានបំណែក SARS-CoV-2 RBD (RBD) ដែលអាចផ្សំឡើងវិញបាន immobilized សម្រាប់
ការភ្ញាស់។ក្នុងអំឡុងពេល incubation 30 នាទី អង្គបដិប្រាណជាក់លាក់ RBD នៅក្នុងម៉ាស៊ីនក្រិតតាមខ្នាត QC និង
គំរូនឹងប្រកួតប្រជែងជាមួយ hACE2-HRP សម្រាប់ការចងជាក់លាក់ RBD immobilized នៅក្នុងអណ្តូង។បន្ទាប់ពី
incubation អណ្តូងត្រូវបានទឹកនាំទៅ 4 ដងដើម្បីយកចេញ unbound hACE2-HRP conjugate ។ដំណោះស្រាយមួយនៃ
បន្ទាប់មក TMB ត្រូវបានបន្ថែមនិង incubated 20 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ដែលជាលទ្ធផលនៅក្នុងការអភិវឌ្ឍនៃ a
ពណ៌ខៀវ។ការអភិវឌ្ឍន៍ពណ៌ត្រូវបានបញ្ឈប់ជាមួយនឹងការបន្ថែម 1N HCl ហើយការស្រូបយកគឺ
វាស់ spectrophotometrically នៅ 450 nm ។អាំងតង់ស៊ីតេនៃពណ៌ដែលបានបង្កើតឡើងគឺសមាមាត្រទៅនឹង
បរិមាណនៃអង់ស៊ីមដែលមានវត្តមាន និងត្រូវបានទាក់ទងច្រាសទៅនឹងបរិមាណនៃស្តង់ដារដែលបានធ្វើពិសោធន៍តាមរបៀបដូចគ្នា។
តាមរយៈការប្រៀបធៀបជាមួយនឹងខ្សែកោងក្រិតដែលបង្កើតឡើងដោយឧបករណ៍ក្រិតតាមខ្នាតដែលបានផ្តល់ការប្រមូលផ្តុំនៃ
បន្ទាប់មកការបន្សាបអង្គបដិប្រាណនៅក្នុងគំរូដែលមិនស្គាល់ត្រូវបានគណនា។
【សម្ភារៈដែលត្រូវការ ប៉ុន្តែមិនត្រូវបានផ្តល់ឱ្យទេ។】
1. ទឹកចម្រោះ ឬ deionized
2. បំពង់ដែលមានភាពជាក់លាក់៖ 10μL, 100μL, 200μL និង 1 mL
3. គន្លឹះបំពង់ដែលអាចចោលបាន។
4. Microplate reader មានសមត្ថភាពអានស្រូបនៅ 450nm។
5. ក្រដាសស្រូបយក
6. ក្រដាសក្រាហ្វ
7. ឧបករណ៍លាយ Vortex ឬសមមូល
【ការប្រមូល និងស្តុកទុកគំរូ】
1. សំណាកសេរ៉ូម និងប្លាស្មាដែលប្រមូលបានក្នុងបំពង់ដែលមាន K2-EDTA អាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់ឧបករណ៍នេះ។
2. សំណាកគំរូគួរតែត្រូវបានបិទ ហើយអាចរក្សាទុកបានរហូតដល់ 48 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 2°C - 8°C មុនពេលធ្វើតេស្ត។
សំណាកដែលរក្សាទុកក្នុងរយៈពេលយូរ (រហូតដល់ 6 ខែ) គួរតែត្រូវបានកកតែម្តងប៉ុណ្ណោះនៅសីតុណ្ហភាព -20 °C មុនពេលធ្វើតេស្ត។
ជៀសវាងវដ្តនៃការកកម្តងហើយម្តងទៀត។
ពិធីការ
【ការរៀបចំ Reagent】
1. សារធាតុ reagents ទាំងអស់ត្រូវតែយកចេញពីទូរទឹកកក ហើយអនុញ្ញាតឱ្យត្រលប់ទៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់វិញមុនពេលប្រើប្រាស់
(20 °ទៅ 25 ° C) ។រក្សាទុកសារធាតុប្រតិកម្មទាំងអស់នៅក្នុងទូទឹកកកភ្លាមៗបន្ទាប់ពីប្រើប្រាស់រួច។
2. រាល់សំណាក និងការត្រួតពិនិត្យទាំងអស់គួរតែត្រូវបាន vortexed មុនពេលប្រើប្រាស់។
3. ការរៀបចំដំណោះស្រាយ hACE2-HRP: រំលាយ hACE2-HRP ប្រមូលផ្តុំនៅសមាមាត្រ 1: 51 dilution ជាមួយ Dilution
សតិបណ្ដោះអាសន្ន។ឧទាហរណ៍ រំលាយ 100 μL នៃ hACE2-HRP ប្រមូលផ្តុំជាមួយ 5.0mL នៃ HRP Dilution Buffer ទៅ
បង្កើតដំណោះស្រាយ hACE2-HRP ។
4. 1 × ការរៀបចំដំណោះស្រាយលាងសម្អាត៖ ពនលាយដំណោះស្រាយលាងសម្អាត 20 × ជាមួយទឹក deionized ឬ distilled ជាមួយ a
សមាមាត្របរិមាណ 1:19 ។ឧទាហរណ៍ រំលាយ 20 mL នៃ 20 × Wash Solution ជាមួយនឹង 380 mL នៃ deionized ឬ
ទឹកចម្រោះដើម្បីធ្វើ 400 មីលីលីត្រនៃដំណោះស្រាយ 1 × លាងសមាត។
【នីតិវិធីសាកល្បង】
1. នៅក្នុងបំពង់ដាច់ដោយឡែក aliquot 120μLនៃដំណោះស្រាយ hACE2-HRP ដែលបានរៀបចំ។
2. បន្ថែម 6 μL នៃ calibrators, គំរូមិនស្គាល់, ការត្រួតពិនិត្យគុណភាពនៅក្នុងបំពង់គ្នានិងលាយផងដែរ។
3. ផ្ទេរ 100μL នៃល្បាយនីមួយៗដែលបានរៀបចំក្នុងជំហានទី 2 ទៅក្នុងអណ្តូងមីក្រូប្លាតដែលត្រូវគ្នា។
ទៅនឹងការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធសាកល្បងដែលបានកំណត់ទុកជាមុន។
3. គ្របចានជាមួយ Plate Sealer និង incubate នៅសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 30 នាទី។
4. យក Plate Sealer ចេញ ហើយលាងចានជាមួយនឹងទឹកប្រហែល 300 μL នៃ 1× Wash Solution ក្នុងមួយអណ្តូងចំនួន 4 ដង។
5. ប៉ះចាននៅលើកន្សែងក្រដាសដើម្បីយករាវដែលនៅសេសសល់នៅក្នុងអណ្តូងបន្ទាប់ពីជំហានលាង។
6. បន្ថែម 100 μL នៃ TMB Solution ទៅអណ្តូងនីមួយៗ ហើយដាក់ចានក្នុងទីងងឹតនៅសីតុណ្ហភាព 20 - 25°C រយៈពេល 20 នាទី។
7. បន្ថែម 50 μLនៃដំណោះស្រាយបញ្ឈប់ទៅអណ្តូងនីមួយៗដើម្បីបញ្ឈប់ប្រតិកម្ម។
8. អានការស្រូបយកនៅក្នុង microplate reader នៅ 450 nm ក្នុងរយៈពេល 10 នាទី (630nm ជាគ្រឿងបន្លាស់។
បានណែនាំសម្រាប់ការអនុវត្តភាពជាក់លាក់ខ្ពស់)។
