SARS-CoV-2 бейтараптандыратын антиденелерді анықтау жинағы (ELISA)
【ПРИНЦИП】
SARS-CoV-2 бейтараптандыратын антиденелерді анықтау жинағы бәсекеге қабілетті ELISA әдістемесіне негізделген.
Тазартылған рецепторларды байланыстыратын доменді (RBD), вирустық спике (S) протеинінен және хост жасушасынан алынған ақуызды пайдалану
ACE2 рецепторы, бұл сынақ вирус-хосттың бейтараптандыратын әрекеттесуін имитациялауға арналған.
Калибраторлар, сапаны бақылау құралдары және сарысу немесе плазма үлгілері сұйылтуда жеке жақсы араласады
шағын түтіктерде аликвотталған hACE2-HRP конъюгаты бар буфер. Содан кейін қоспалар жіберіледі
үшін иммобилизацияланған рекомбинантты SARS-CoV-2 RBD фрагменті (RBD) бар микропластиналық шұңқырлар
инкубация. 30 минуттық инкубация кезінде калибраторлардағы RBD спецификалық антидене, QC және
үлгілер ұңғымаларда иммобилизацияланған RBD-ны арнайы байланыстыру үшін hACE2-HRP-мен бәсекелеседі. Кейін
инкубациялау кезінде ұңғымалар байланыспаған hACE2-HRP конъюгатын жою үшін 4 рет жуылады. ерітіндісі
Содан кейін ТМБ қосылады және бөлме температурасында 20 минут инкубацияланады, нәтижесінде а
көк түс. Түс дамуы 1N HCl қосылғанда тоқтатылады, ал абсорбция болады
450 нм-де спектрофотометриялық түрде өлшенеді. Түзілген түстің қарқындылығы -ға пропорционал
бар ферменттің мөлшері және сол әдіспен тексерілген стандарттар санына кері байланысты.
Берілген калибраторлармен құрылған калибрлеу қисығымен салыстыру арқылы концентрациясы
содан кейін белгісіз үлгідегі бейтараптандыратын антиденелер есептеледі.
【ҚАЖЕТТІ БІРАҚ БЕРІЛМЕЙТІН МАТЕРИАЛДАР】
1. Дистилденген немесе ионсыздандырылған су
2. Дәл тамшуырлар: 10μL, 100μL, 200μL және 1 мл
3. Бір рет қолданылатын тамшуыр ұштары
4. 450 нм абсорбентті оқуға қабілетті микропластинаны оқу құралы.
5. Сіңіргіш қағаз
6. Графикалық қағаз
7. Құйынды араластырғыш немесе эквивалент
【ҮЛГІЛЕРДІ ЖИНАУ ЖӘНЕ САҚТАУ】
1. Құрамында K2-EDTA бар түтіктерде жиналған сарысу мен плазма үлгілерін осы жинақ үшін пайдалануға болады.
2. Үлгілерді тығындау керек және талдаудан бұрын 2 °C - 8 °C температурада 48 сағатқа дейін сақтауға болады.
Ұзақ уақыт (6 айға дейін) ұсталған үлгілерді талдау алдында -20 °C температурада тек бір рет мұздату керек.
Қайталанатын мұздату-еріту циклдарынан аулақ болыңыз.
ПРОТОКОЛ
【Реагент дайындау】
1. Қолданар алдында барлық реагенттерді тоңазытқыштан шығарып, бөлме температурасына қайтару керек
(20° - 25°C). Барлық реагенттерді қолданғаннан кейін дереу тоңазытқышта сақтаңыз.
2. Қолданар алдында барлық үлгілер мен бақылау элементтерін құйып алу керек.
3. hACE2-HRP ерітіндісін дайындау: hACE2-HRP концентратын сұйылтумен 1: 51 сұйылту қатынасында сұйылтыңыз.
Буфер. Мысалы, 100 мкл hACE2-HRP концентратын 5,0 мл HRP сұйылту буферімен сұйылтыңыз.
hACE2-HRP ерітіндісін жасаңыз.
4. 1× жууға арналған ерітіндіні дайындау: 20× жуу ерітіндісін ионсыздандырылған немесе тазартылған сумен сұйылтыңыз.
көлем қатынасы 1:19. Мысалы, 20 мл 20 × жуу ерітіндісін 380 мл деионизацияланған немесе
400 мл 1× жуу ерітіндісін жасау үшін тазартылған су.
【Сынақ процедурасы】
1. Бөлек түтіктерде дайындалған hACE2-HRP ерітіндісінің 120 мкл аликвоты.
2. Әрбір түтікке 6 мкл калибраторларды, белгісіз үлгілерді, сапаны бақылау элементтерін қосып, жақсылап араластырыңыз.
3. 2-қадамда дайындалған әрбір қоспаның 100 мкл мөлшерін сәйкес микропластиналық ұңғымаларға салыңыз.
алдын ала әзірленген сынақ конфигурациясына.
3. Пластинаны пластина тығыздағышпен жабыңыз және 37°C температурада 30 минут бойы инкубациялаңыз.
4. Пластина тығыздағышын алып тастаңыз және пластинаны шамамен 300 мкл 1× жуу ерітіндісімен бір ұңғымаға төрт рет жуыңыз.
5. Жуу қадамдарынан кейін шұңқырлардағы қалдық сұйықтықты кетіру үшін тақтаны қағаз сүлгіге түртіңіз.
6. Әрбір ұңғымаға 100 мкл TMB ерітіндісін құйыңыз және пластинаны қараңғы жерде 20 - 25°C температурада 20 минут бойы инкубациялаңыз.
7. Реакцияны тоқтату үшін әрбір шұңқырға 50 мкл тоқтату ерітіндісін қосыңыз.
8. 10 минут ішінде микропластиналарды оқу құрылғысында 450 нм жиіліктегі абсорбцияны оқыңыз (қосымша құрал ретінде 630 нм).
жоғары дәлдік өнімділігі үшін ұсынылады).