SARS-CoV-2 ანეიტრალებელი ანტისხეულების გამოვლენის ნაკრები (ELISA)
【პრინციპი】
SARS-CoV-2 ნეიტრალიზებული ანტისხეულების გამოვლენის ნაკრები ეფუძნება კონკურენტულ ELISA მეთოდოლოგიას.
გაწმენდილი რეცეპტორების დამაკავშირებელი დომენის (RBD) გამოყენებით, ვირუსული სპაიკის (S) პროტეინის და მასპინძელი უჯრედის პროტეინი
რეცეპტორი ACE2, ეს ტესტი შექმნილია ვირუსისა და მასპინძლის განეიტრალებელი ურთიერთქმედების იმიტაციისთვის.
კალიბრატორები, ხარისხის კონტროლი და შრატის ან პლაზმის ნიმუშები ინდივიდუალურად კარგად არის შერეული განზავებაში
ბუფერი, რომელიც შეიცავს hACE2-HRP კონიუგატს, ალიკოტირებული პატარა მილებში. შემდეგ ნარევები გადაიტანება შიგნით
მიკროფირფიტის ჭაბურღილები, რომლებიც შეიცავს იმობილიზებულ რეკომბინანტულ SARS-CoV-2 RBD ფრაგმენტს (RBD)
ინკუბაცია. 30-წუთიანი ინკუბაციის დროს, RBD სპეციფიკური ანტისხეულები კალიბრატორებში, QC და
ნიმუშები კონკურენციას გაუწევს hACE2-HRP-ს ჭაბურღილებში იმობილიზებული RBD-ის სპეციფიკური შებოჭვისთვის. შემდეგ
ინკუბაციის დროს, ჭები ირეცხება 4-ჯერ, რათა მოიხსნას შეუზღუდავი hACE2-HRP კონიუგატი. გამოსავალი
შემდეგ ემატება TMB და ინკუბირებულია 20 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე, რის შედეგადაც ვითარდება a
ლურჯი ფერი. ფერის განვითარება ჩერდება 1N HCl-ის დამატებით და აბსორბცია ხდება
გაზომილი სპექტროფოტომეტრიულად 450 ნმ. ჩამოყალიბებული ფერის ინტენსივობა პროპორციულია
არსებული ფერმენტის რაოდენობა და საპირისპიროდ არის დაკავშირებული იმავე გზით შეფასებული სტანდარტების რაოდენობასთან.
მოწოდებული კალიბრატორების მიერ წარმოქმნილ კალიბრაციის მრუდთან შედარების გზით, კონცენტრაცია
შემდეგ გამოითვლება უცნობ ნიმუშში განეიტრალებელი ანტისხეულები.
【მასალები საჭირო, მაგრამ არ არის მოწოდებული】
1. გამოხდილი ან დეიონიზებული წყალი
2. ზუსტი პიპეტები: 10 μL, 100 μL, 200 μL და 1 მლ
3. ერთჯერადი პიპეტის წვერები
4. მიკროპლატის წამკითხველი, რომელსაც შეუძლია წაიკითხოს შთანთქმა 450 ნმ.
5. შთამნთქმელი ქაღალდი
6. გრაფიკული ქაღალდი
7. Vortex mixer ან ექვივალენტი
【ნიმუშების შეგროვება და შენახვა】
1. ამ ნაკრებისთვის შეიძლება გამოყენებულ იქნას შრატისა და პლაზმის ნიმუშები, რომლებიც შეგროვებულია K2-EDTA-ს შემცველ ტუბებში.
2. ნიმუშები უნდა დაიხუროს თავსახური და შეიძლება ინახებოდეს 48 საათის განმავლობაში 2 °C - 8 °C ტემპერატურაზე ანალიზის დაწყებამდე.
ნიმუშები, რომლებიც ინახება უფრო დიდხანს (6 თვემდე) უნდა გაიყინოს მხოლოდ ერთხელ -20 °C-ზე ანალიზის დაწყებამდე.
მოერიდეთ გაყინვა-დათბობის განმეორებით ციკლებს.
პროტოკოლი
【რეაგენტის მომზადება】
1. გამოყენებამდე ყველა რეაგენტი უნდა ამოიღოთ მაცივრიდან და დაბრუნდეს ოთახის ტემპერატურაზე
(20°-დან 25°C-მდე). გამოყენების შემდეგ დაუყოვნებლივ შეინახეთ ყველა რეაგენტი მაცივარში.
2. გამოყენებამდე ყველა ნიმუში და კონტროლი უნდა იყოს მორევი.
3. hACE2-HRP ხსნარის მომზადება: განზავდეს hACE2-HRP კონცენტრატი 1:51 განზავების თანაფარდობით განზავით
ბუფერი. მაგალითად, განზავდეს 100 μL hACE2-HRP კონცენტრატი 5.0 მლ HRP განზავების ბუფერით.
გააკეთეთ hACE2-HRP ხსნარი.
4. 1× სარეცხი ხსნარი მომზადება: 20× სარეცხი ხსნარი განზავდეს დეიონიზებული ან გამოხდილი წყლით.
მოცულობის თანაფარდობა 1:19. მაგალითად, განზავდეს 20 მლ 20× სარეცხი ხსნარი 380 მლ დეიონიზებული ან
გამოხდილი წყალი 400 მლ 1× სარეცხი ხსნარის მისაღებად.
【ტესტირების პროცედურა】
1. ცალკეულ მილებში, აკრიფეთ 120 μL მომზადებული hACE2-HRP ხსნარი.
2. თითოეულ მილში დაამატეთ 6 μL კალიბრატორები, უცნობი ნიმუშები, ხარისხის კონტროლი და კარგად აურიეთ.
3. გადაიტანეთ მე-2 ეტაპზე მომზადებული თითოეული ნარევიდან 100 μL შესაბამის მიკროფირფიტის ჭებში, შესაბამისად
წინასწარ შემუშავებული სატესტო კონფიგურაციისთვის.
3. დააფარეთ ფირფიტა Plate Sealer-ით და გააჩერეთ 37°C-ზე 30 წუთის განმავლობაში.
4. ამოიღეთ ფირფიტის დალუქვი და გარეცხეთ ფირფიტა დაახლოებით 300 μL 1× სარეცხი ხსნარით თითო ჭაბურღილში ოთხჯერ.
5. დაკრათ ფირფიტა ქაღალდის პირსახოცზე, რათა ამოიღოთ ნარჩენი სითხე ჭაბურღილების სარეცხი ნაბიჯების შემდეგ.
6. დაამატეთ 100 μL TMB Solution თითოეულ ჭაბურღილს და ჩადეთ ფირფიტა სიბნელეში 20 - 25°C ტემპერატურაზე 20 წუთის განმავლობაში.
7. რეაქციის შესაჩერებლად თითოეულ ჭაბურღილს დაამატეთ 50 μL Stop Solution.
8. წაიკითხეთ შთანთქმა მიკროფირფიტის მკითხველში 450 ნმ-ზე 10 წუთის განმავლობაში (630 ნმ, როგორც აქსესუარი არის
რეკომენდებულია უფრო მაღალი სიზუსტის შესრულებისთვის).