SARS-COV-2 ანტისხეულების გამოვლენის ნაკრები (ELISA)
【პრინციპი】
SARS-COV-2 ანტისხეულების გამოვლენის კომპლექტის განეიტრალება ემყარება ELISA- ს კონკურენტულ მეთოდოლოგიას.
გაწმენდილი რეცეპტორის დამაკავშირებელი დომენის (RBD) გამოყენებით, ცილა ვირუსული spike (s) ცილისა და მასპინძელი უჯრედის გამოყენებით
რეცეპტორი ACE2, ეს ტესტი მიზნად ისახავს ვირუს-მასპინძლის ნეიტრალიზაციის ურთიერთქმედების მიბაძვას.
კალიბრატორები, ხარისხის კონტროლი და შრატში ან პლაზმური ნიმუშები ინდივიდუალურად კარგად არის შერეული განზავებაში
ბუფერი, რომელიც შეიცავს HACE2-HRP კონიუგატს, რომელიც შეიცავს მცირე მილაკებში. შემდეგ ნარევები გადადის
მიკროპლატის ჭაბურღილები, რომლებიც შეიცავს იმობილიზებულ რეკომბინანტულ SARS-COV-2 RBD ფრაგმენტს (RBD)
ინკუბაცია. 30 წუთიანი ინკუბაციის დროს, RBD სპეციფიკური ანტისხეული კალიბრატორებში, QC და
ნიმუშები კონკურენციას გაუწევს HACE2-HRP- ს ჭაბურღილებში იმობილიზებული RBD- ს სპეციფიკური სავალდებულოობისთვის. შემდეგ
ინკუბაცია, ჭაბურღილები 4 ჯერ გარეცხილია, რათა ამოიღონ უსაზღვრო HACE2-HRP კონიუგატი. გამოსავალი
TMB შემდეგ ემატება და ინკუბაცია ხდება 20 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე, რის შედეგადაც ხდება ა
ლურჯი ფერი. ფერის განვითარება შეჩერებულია 1N HCl- ის დამატებით, ხოლო აბსორბციაა
გაზომეს სპექტროფოტომეტრიულად 450 ნმ. წარმოქმნილი ფერის ინტენსივობა პროპორციულია
ფერმენტის ოდენობა და საპირისპიროდ არის დაკავშირებული სტანდარტების ოდენობასთან ერთად, ანალოგიურად.
მოწოდებული კალიბრების მიერ წარმოქმნილი კალიბრაციის მრუდთან შედარების გზით, კონცენტრაცია
შემდეგ გამოითვლება ანტისხეულების ანტისხეულების განეიტრალება.
【საჭირო მასალები, მაგრამ არ არის მოწოდებული】
1. გამოხდილი ან დეიონიზირებული წყალი
2. ზუსტი პიპეტები: 10μl, 100μl, 200μl და 1 მლ
3. ერთჯერადი პიპეტის რჩევები
4. მიკროპლატის მკითხველს, რომელსაც შეუძლია წაიკითხოს შთანთქმის 450 ნმ.
5. შთამნთქმელი ქაღალდი
6. გრაფიკის ქაღალდი
7. Vortex მიქსერი ან ექვივალენტი
【ნიმუშების შეგროვება და შენახვა】
1. შრატში და პლაზმური ნიმუშები, რომლებიც შეგროვებულია K2-EDTA- ს შემცველ მილებში, შეიძლება გამოყენებულ იქნას ამ ნაკრებისთვის.
2. ნიმუშები უნდა იყოს დაფარული და შეიძლება ინახებოდეს 48 საათამდე 2 ° C- ზე - 8 ° C ტემპერატურაზე.
ნიმუშები, რომლებიც ჩატარდა უფრო მეტ ხანს (6 თვემდე) უნდა გაყინული უნდა იყოს მხოლოდ ერთხელ -20 ° C ტემპერატურაზე, სანამ გამოკვლევამდე.
მოერიდეთ განმეორებით გაყინვის ციკლებს.
ოქმი
【რეაგენტის მომზადება】
1. ყველა რეაგენტი უნდა იქნას ამოღებული მაცივრიდან და გამოყენებამდე ოთახის ტემპერატურაზე დაბრუნების უფლება
(20 ° დან 25 ° C). გამოყენების შემდეგ დაუყოვნებლივ შეინახეთ ყველა რეაგენტი მაცივარში.
2. გამოყენებამდე ყველა ნიმუში და კონტროლი უნდა მოხდეს.
3. HACE2-HRP ხსნარის მომზადება: განზავებული HACE2-HRP კონცენტრატი 1: 51 განზავების თანაფარდობით განზავებით
ბუფერი. მაგალითად, განზავდეს 100 μl HACE2-HRP კონცენტრატი 5.0 მლ HRP განზავების ბუფერით
გააკეთეთ HACE2-HRP გადაწყვეტა.
4. 1 × სარეცხი ხსნარის მომზადება: განზავდეს 20 × სარეცხი ხსნარი დიონიზირებული ან გამოხდილი წყლით
მოცულობის თანაფარდობა 1:19. მაგალითად, განზავდეს 20 მლ 20 × სარეცხი ხსნარით 380 მლ დეიონიზირებული ან
გამოხდილი წყალი 400 მლ 1 × სარეცხი ხსნარის გასაკეთებლად.
【ტესტის პროცედურა】
1. ცალკეულ მილებში, მომზადებული HACE2-HRP ხსნარის 120μl.
2. დაამატეთ 6 μl კალიბრატორი, უცნობი ნიმუშები, ხარისხის კონტროლი თითოეულ მილში და კარგად აურიეთ.
3. გადაიტანეთ 100μl თითოეული ნარევი, რომელიც მომზადებულია მე -2 ნაბიჯში, შესაბამის მიკროპლატის ჭაბურღილებში
წინასწარ დაგეგმილი ტესტის კონფიგურაციისთვის.
3. დააფარეთ ფირფიტა ფირფიტა და ინკუბაცია 37 ° C ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში.
4. ამოიღეთ ფირფიტა გამანადგურებელი და გარეცხეთ ფირფიტა დაახლოებით 300 μl 1 × სარეცხი ხსნარით თითო ჭაბურღილზე ოთხჯერ.
5. დააჭირეთ ფირფიტას ქაღალდის პირსახოცზე, რომ ამოიღოთ ნარჩენი სითხე ჭაბურღილებში, სარეცხი ნაბიჯების შემდეგ.
6. თითოეულ ჭაბურღილზე დაამატეთ 100 μl TMB ხსნარი და შეიტანეთ ფირფიტა სიბნელეში 20 - 25 ° C ტემპერატურაზე 20 წუთის განმავლობაში.
7. დაამატეთ 50 μl გაჩერების ხსნარი თითოეულ ჭაბურღილზე, რომ შეაჩეროთ რეაქცია.
8. წაიკითხეთ შთანთქმის მიკროპლატის მკითხველში 450 ნმ -ზე 10 წუთში (630 ნმ, როგორც აქსესუარი
რეკომენდებულია უფრო მაღალი სიზუსტის შესრულებისთვის).