SARS-CoV-2 中和抗体検出キット (ELISA)
【原理】
SARS-CoV-2 中和抗体検出キットは、競合 ELISA 法に基づいています。
精製された受容体結合ドメイン (RBD)、ウイルススパイク (S) タンパク質および宿主細胞由来のタンパク質を使用
受容体 ACE2 を検出するため、このテストはウイルスと宿主の中和相互作用を模倣するように設計されています。
キャリブレーター、品質管理、血清または血漿サンプルは個別に希釈してよく混合されます
hACE2-HRP コンジュゲートを含むバッファーを小さなチューブに分注します。次に、混合物を次の場所に移します。
固定化された組換え SARS-CoV-2 RBD フラグメント (RBD) を含むマイクロプレートのウェル
インキュベーション。 30 分間のインキュベーション中に、キャリブレーター、QC、および
サンプルは、ウェルに固定化された RBD との特異的結合をめぐって hACE2-HRP と競合します。後
インキュベーション中、ウェルを 4 回洗浄して、未結合の hACE2-HRP コンジュゲートを除去します。の解決策
次に TMB を添加し、室温で 20 分間インキュベートすると、
青色。 1N HCl を添加すると発色が止まり、吸光度は
450 nm で分光光度的に測定。形成される色の強度は次のように比例します。
存在する酵素の量であり、同じ方法でアッセイされる標準の量に反比例します。
付属のキャリブレーターによって作成された検量線との比較により、
次に、未知のサンプルの中の中和抗体が計算されます。
【必要な資料が提供されていない】
1. 蒸留水または脱イオン水
2. 精密ピペット: 10μL、100μL、200μL、1 mL
3. 使い捨てピペットチップ
4. 450nmの吸光度を読み取ることができるマイクロプレートリーダー。
5.吸収紙
6.方眼紙
7. ボルテックスミキサーまたは同等品
【検体の収集と保管】
1. K2-EDTA を含むチューブに採取された血清および血漿サンプルは、このキットに使用できます。
2. 検体はキャップをし、アッセイ前に 2 °C ～ 8 °C で最大 48 時間保存できます。
長期間（最長 6 か月）保存した検体は、アッセイ前に -20 °C で 1 回だけ凍結する必要があります。
凍結融解を繰り返すことは避けてください。
プロトコル
【試薬の準備】
1. すべての試薬は、使用前に冷蔵庫から取り出し、室温に戻す必要があります。
(20°～25°C)。すべての試薬は使用後すぐに冷蔵庫に保存してください。
2. すべてのサンプルとコントロールは使用前にボルテックスする必要があります。
3. hACE2-HRP 溶液の調製: hACE2-HRP 濃縮物を Dilution で 1:51 の希釈率で希釈します。
バッファ。たとえば、100 μL の hACE2-HRP 濃縮物を 5.0 mL の HRP 希釈バッファーで希釈すると、
hACE2-HRP溶液を作成します。
4. 1×洗浄溶液の調製: 20×洗浄溶液を脱イオン水または蒸留水で希釈します。
体積比は1:19。たとえば、20 mL の 20× Wash Solution を 380 mL の脱イオン洗浄液で希釈します。
蒸留水を加えて 400 mL の 1× Wash Solution を作ります。
【試験手順】
1. 調製した hACE2-HRP 溶液 120μL を別のチューブに取ります。
2. 各チューブに 6 μL のキャリブレーター、未知のサンプル、品質管理を加え、よく混合します。
3. ステップ 2 で調製した各混合物 100μL を、次の手順に従って対応するマイクロプレートのウェルに移します。
事前に設計されたテスト構成に。
3. プレートシーラーでプレートを覆い、37℃で 30 分間インキュベートします。
4. プレートシーラーを取り外し、ウェルあたり約 300 μL の 1× 洗浄溶液でプレートを 4 回洗浄します。
5. 洗浄ステップ後にプレートをペーパータオル上で軽くたたき、ウェル内の残留液体を除去します。
6. 100 μL の TMB 溶液を各ウェルに加え、プレートを暗所、20 ～ 25℃で 20 分間インキュベートします。
7. 各ウェルに Stop Solution 50 μL を加えて反応を停止します。
8. マイクロプレートリーダーで 450 nm で 10 分以内に吸光度を読み取ります (付属品として 630 nm)。
より高精度のパフォーマンスを実現するために推奨されます)。