ערכת זיהוי נוגדנים מנטרל SARS-CoV-2 (ELISA)
【עִקָרוֹן】
ערכת SARS-CoV-2 מנטרל נוגדנים לגילוי נוגדנים מבוססת על מתודולוגיית ELISA תחרותית.
באמצעות תחום מחייב קולטן מטוהר (RBD), חלבון מהחלבון הנגיפי (S) ומהתא המארח
קולטן ACE2, בדיקה זו נועדה לחקות את האינטראקציה המנטרלת וירוס-מארח.
מכיילים, בקרות איכות ודגימות סרום או פלזמה מעורבבים היטב בנפרד בדילול
חיץ המכיל מצומד hACE2-HRP במנה בצינורות קטנים. ואז התערובות מועברות פנימה
בארות המיקרו-לוחיות המכילות שבר RBD רקומביננטי SARS-CoV-2 (RBD) משותק עבור
דְגִירָה. במהלך הדגירה של 30 דקות, הנוגדן הספציפי ל-RBD בכיילים, QC ו
דגימות יתחרו עם hACE2-HRP על קשירה ספציפית של ה-RBD המשוקע בבארות. לְאַחַר
בדגירה, הארות נשטפות 4 פעמים כדי להסיר מצמיד hACE2-HRP לא קשור. פתרון של
לאחר מכן מוסיפים TMB ומודגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, וכתוצאה מכך נוצרת א
צבע כחול. התפתחות הצבע נעצרת בתוספת 1N HCl, והספיגה היא
נמדד ספקטרופוטומטרי ב-450 ננומטר. עוצמת הצבע שנוצר היא פרופורציונלית ל
כמות האנזים הקיימת, והיא ביחס הפוך לכמות התקנים שנבדקו באותו אופן.
באמצעות השוואה עם עקומת הכיול שנוצרה על ידי המכיילים שסופקו, הריכוז של
לאחר מכן מחושב נוגדנים מנטרלים בדגימה הלא ידועה.
【חומרים נדרשים אך לא סופקו】
1. מים מזוקקים או דה-יונים
2. פיפטות דיוק: 10μL, 100μL, 200μL ו-1 מ"ל
3. קצוות פיפטה חד פעמיים
4. קורא Microplate המסוגל לקרוא ספיגה ב-450nm.
5. נייר סופג
6. נייר גרפי
7. מערבל וורטקס או שווה ערך
【איסוף ואחסון דגימות】
1. ניתן להשתמש בדגימות סרום ופלזמה שנאספו בצינורות המכילים K2-EDTA עבור ערכה זו.
2. יש לכסות את הדגימות וניתן לאחסן אותן עד 48 שעות בטמפרטורה של 2°C - 8°C לפני הבדיקה.
יש להקפיא את הדגימות למשך זמן ארוך יותר (עד 6 חודשים) פעם אחת בלבד ב-20 מעלות צלזיוס לפני הבדיקה.
הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים.
פּרוֹטוֹקוֹל
【הכנת ריאגנטים】
1. יש להוציא את כל הריאגנטים מהקירור ולאפשר להם לחזור לטמפרטורת החדר לפני השימוש
(20 עד 25 מעלות צלזיוס). שמור את כל הריאגנטים במקרר מיד לאחר השימוש.
2. יש לסובב את כל הדגימות והבקרות לפני השימוש.
3. הכנת תמיסת hACE2-HRP: דלל תרכיז hACE2-HRP ביחס דילול של 1:51 עם דילול
בַּלָם. לדוגמה, דלל 100 μL של תרכיז hACE2-HRP עם 5.0 מ"ל של מאגר דילול HRP כדי
להכין פתרון hACE2-HRP.
4. הכנת תמיסת כביסה 1×: דלל את תמיסת הכביסה 20× במים מפושטים או מזוקקים עם
יחס נפח של 1:19. לדוגמה, דלל 20 מ"ל של תמיסת כביסה 20× עם 380 מ"ל של דה-יון או
מים מזוקקים להכנת 400 מ"ל של תמיסת כביסה 1×.
【נוהל בדיקה】
1. בצינורות נפרדים, מנה 120μL מתמיסת hACE2-HRP המוכנה.
2. הוסף 6 μL של מכיילים, דגימות לא ידועות, בקרות איכות בכל צינור וערבב היטב.
3. העבירו 100μL מכל תערובת שהוכנה בשלב 2 לתוך בארות המיקרו-פלט המתאימות לפי
לתצורת בדיקה מתוכננת מראש.
3. מכסים את הצלחת עם סילר צלחות ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
4. הסר את אוטם הצלחות ושטוף את הצלחת עם כ-300 μL של תמיסת כביסה 1× לבאר במשך ארבע פעמים.
5. הקש על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר שאריות נוזלים בבארות לאחר שלבי הכביסה.
6. הוסף 100 μL של תמיסת TMB לכל באר ודגרו את הצלחת בחושך ב-20 - 25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
7. הוסף 50 μL של תמיסת עצור לכל באר כדי לעצור את התגובה.
8. קרא את הספיגה בקורא microplate ב-450 ננומטר תוך 10 דקות (630 ננומטר כאביזר הוא
מומלץ לביצועים מדויקים יותר).