Kit di rilevamento di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINCIPIO】
Il kit di rilevamento degli anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 si basa sulla metodologia ELISA competitiva.
Utilizzando il dominio di legame del recettore purificato (RBD), la proteina della proteina virale (S) e la cellula ospite
recettore ACE2, questo test è progettato per imitare l’interazione neutralizzante virus-ospite.
I calibratori, i controlli di qualità e i campioni di siero o plasma vengono miscelati bene singolarmente in diluizione
tampone contenente il coniugato hACE2-HRP aliquotato in piccole provette. Successivamente si trasferiscono le miscele
i pozzetti della micropiastra contenenti il frammento RBD ricombinante immobilizzato di SARS-CoV-2 (RBD) per
incubazione. Durante l'incubazione di 30 minuti, l'anticorpo specifico RBD nei calibratori, QC e
i campioni competeranno con hACE2-HRP per il legame specifico con l'RBD immobilizzato nei pozzetti. Dopo
Dopo l'incubazione, i pozzetti vengono lavati 4 volte per rimuovere il coniugato hACE2-HRP non legato. Una soluzione di
Viene quindi aggiunto il TMB e incubato per 20 minuti a temperatura ambiente, determinando lo sviluppo di a
colore blu. Lo sviluppo del colore viene arrestato con l'aggiunta di HCl 1N e l'assorbanza viene arrestata
misurato spettrofotometricamente a 450 nm. L'intensità del colore formato è proporzionale al
quantità di enzima presente ed è inversamente proporzionale alla quantità di standard analizzati nello stesso modo.
Attraverso il confronto con la curva di calibrazione formata dai calibratori forniti, la concentrazione di
Vengono quindi calcolati gli anticorpi neutralizzanti nel campione sconosciuto.
【MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI】
1. Acqua distillata o deionizzata
2. Pipette di precisione: 10μL, 100μL, 200μL e 1 ml
3. Puntali per pipette monouso
4. Lettore di micropiastre in grado di leggere l'assorbanza a 450 nm.
5. Carta assorbente
6. Carta millimetrata
7. Miscelatore Vortex o equivalente
【RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI】
1. Per questo kit è possibile utilizzare campioni di siero e plasma raccolti in provette contenenti K2-EDTA.
2. I campioni devono essere chiusi con tappo e possono essere conservati fino a 48 ore a 2 °C - 8 °C prima dell'analisi.
I campioni conservati per un periodo più lungo (fino a 6 mesi) devono essere congelati solo una volta a -20 °C prima del test.
Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.
PROTOCOLLO
【Preparazione dei reagenti】
1. Tutti i reagenti devono essere tolti dal frigorifero e lasciati ritornare a temperatura ambiente prima dell'uso
(da 20° a 25°C). Conservare tutti i reagenti in frigorifero subito dopo l'uso.
2. Tutti i campioni e i controlli devono essere agitati su vortex prima dell'uso.
3. Preparazione della soluzione hACE2-HRP: diluire il concentrato hACE2-HRP con un rapporto di diluizione 1: 51 con diluizione
Respingente. Ad esempio, diluire 100 μL di concentrato hACE2-HRP con 5,0 ml di tampone di diluizione HRP per
creare una soluzione hACE2-HRP.
4. Preparazione della soluzione di lavaggio 1×: diluire la soluzione di lavaggio 20× con acqua deionizzata o distillata con un
rapporto volumetrico di 1:19. Ad esempio, diluire 20 ml di soluzione di lavaggio 20× con 380 ml di soluzione deionizzata o
acqua distillata per ottenere 400 ml di soluzione di lavaggio 1×.
【Procedura di prova】
1. In provette separate, aliquotare 120μL della soluzione hACE2-HRP preparata.
2. Aggiungere 6 μL di calibratori, campioni sconosciuti e controlli di qualità in ciascuna provetta e mescolare bene.
3. Trasferire 100μL di ciascuna miscela preparata nella fase 2 nei corrispondenti pozzetti della micropiastra secondo
alla configurazione di prova predefinita.
3. Coprire la piastra con il sigillante per piastre e incubare a 37°C per 30 minuti.
4. Rimuovere il sigillante per piastra e lavare la piastra con circa 300 μL di soluzione di lavaggio 1× per pozzetto per quattro volte.
5. Picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido residuo nei pozzetti dopo le fasi di lavaggio.
6. Aggiungere 100 μL di soluzione TMB a ciascun pozzetto e incubare la piastra al buio a 20 - 25°C per 20 minuti.
7. Aggiungere 50 μl di soluzione bloccante in ciascun pozzetto per arrestare la reazione.
8. Leggere l'assorbanza nel lettore per micropiastre a 450 nm entro 10 minuti (630 nm come accessorio
consigliato per prestazioni di precisione più elevate).