SARS-CoV-2 hlutleysandi mótefnagreiningarsett (ELISA)
【MEGINREGLA】
SARS-CoV-2 hlutleysandi mótefnagreiningarsett er byggt á samkeppnishæfri ELISA aðferðafræði.
Með því að nota hreinsað viðtakabindingarsvæði (RBD), prótein úr veirubroddnum (S) próteini og hýsilfrumunni
viðtaka ACE2, þetta próf er hannað til að líkja eftir hlutleysandi milliverkun vírusa og hýsils.
Kvörðum, gæðaeftirliti og sermi- eða plasmasýnum er blandað vel saman í þynningu hvert fyrir sig
stuðpúði sem inniheldur hACE2-HRP samtengt skammt í litlum glösum. Síðan eru blöndurnar fluttar inn
örplötuholurnar sem innihalda óhreyfanlegt raðbrigða SARS-CoV-2 RBD brot (RBD) fyrir
ræktun. Meðan á 30 mínútna ræktun stendur mun RBD sértæka mótefnið í kvörðunum, QC og
sýni munu keppa við hACE2-HRP um sérstaka bindingu RBD sem er óhreyfður í brunnunum. Eftir
við ræktunina eru holurnar þvegnar 4 sinnum til að fjarlægja óbundið hACE2-HRP samtengingu. Lausn á
TMB er síðan bætt við og ræktað í 20 mínútur við stofuhita, sem leiðir til myndunar a
blár litur. Litaþróunin er stöðvuð með því að bæta við 1N HCl og gleypnin er
mæld með litrófsmælingu við 450 nm. Styrkur litarins sem myndast er í réttu hlutfalli við
magn ensíms sem er til staðar og er öfugt við magn staðla sem eru mældir á sama hátt.
Með samanburði við kvörðunarferilinn sem myndaður er af kvörðunartækjunum sem fylgir, styrkur á
hlutleysandi mótefni í óþekkta sýninu eru síðan reiknuð út.
【EFNI ÁSKILD EN EKKI LEYFIÐ】
1. Eimað eða afjónað vatn
2. Nákvæmni pípettur: 10μL, 100μL, 200μL og 1 mL
3. Einnota pípettuoddar
4. Örplötulesari sem getur lesið gleypni við 450nm.
5. Gleypandi pappír
6. Línurit
7. Vortex hrærivél eða sambærilegt
【PRÍTASÖFNUN OG GEYMSLA】
1. Hægt er að nota sermi- og plasmasýni sem safnað er í glös sem innihalda K2-EDTA fyrir þetta sett.
2. Sýnin eiga að vera með loki og þau má geyma í allt að 48 klukkustundir við 2 °C - 8 °C áður en greiningin hefst.
Sýni sem geymd eru í lengri tíma (allt að 6 mánuði) á aðeins að frysta einu sinni við -20 °C fyrir prófun.
Forðist endurteknar frystingar-þíðingarlotur.
BÓKUN
【Undirbúningur hvarfefnis】
1. Taka verður öll hvarfefni úr kæli og láta þau ná stofuhita fyrir notkun
(20° til 25°C). Geymið öll hvarfefni í kæli strax eftir notkun.
2. Öll sýni og eftirlit ætti að hringsnúa fyrir notkun.
3. hACE2-HRP lausn Undirbúningur: Þynntu hACE2-HRP þykkni í 1:51 þynningarhlutfalli með þynningu
Buffer. Til dæmis, þynntu 100 μL af hACE2-HRP þykkni með 5,0 ml af HRP þynningarbuffi til að
búa til hACE2-HRP lausn.
4. 1× þvottalausn Undirbúningur: Þynntu 20× þvottalausnina með afjónuðu eða eimuðu vatni með
rúmmálshlutfall 1:19. Til dæmis, þynntu 20 ml af 20× þvottalausn með 380 ml af afjónuðu eða
eimað vatn til að búa til 400 ml af 1× þvottalausn.
【Prófunaraðferð】
1. Í aðskildum glösum, deilið 120μL af tilbúinni hACE2-HRP lausn.
2. Bætið 6 μL af kvörðunartækjum, óþekktum sýnum, gæðaeftirliti í hvert glas og blandið vel saman.
3. Flyttu 100μL af hverri blöndu sem var útbúin í skrefi 2 yfir í samsvarandi örplötubrunn skv.
að forhönnuðum prófunarstillingum.
3. Hyljið plötuna með Plate Sealer og ræktið við 37°C í 30 mínútur.
4. Fjarlægðu plötuþéttinguna og þvoðu plötuna með um það bil 300 μL af 1× þvottalausn í hverri brunn í fjórum sinnum.
5. Bankaðu plötunni á pappírshandklæði til að fjarlægja leifar af vökva í brunnunum eftir þvottaskref.
6. Bætið 100 μL af TMB lausn í hvern brunn og ræktið plötuna í myrkri við 20 - 25°C í 20 mínútur.
7. Bætið 50 μL af stöðvunarlausn í hvern brunn til að stöðva hvarfið.
8. Lesið gleypni í örplötulesara við 450 nm innan 10 mínútna (630 nm sem fylgihlutur er
mælt með meiri nákvæmni).