Kit Deteksi Antibodi Penetral SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINSIP】
Kit Deteksi Antibodi Penetral SARS-CoV-2 didasarkan pada metodologi ELISA yang kompetitif.
Menggunakan purified receptor binding domain (RBD), protein dari protein spike virus (S) dan sel inang
reseptor ACE2, tes ini dirancang untuk meniru interaksi penetralisir virus-host.
Kalibrator, Kontrol Kualitas, dan sampel serum atau plasma dicampur secara terpisah dalam pengenceran
buffer yang mengandung konjugat hACE2-HRP yang diakuisisi dalam tabung kecil.Kemudian campuran dipindahkan ke dalam
sumur lempeng mikro yang mengandung fragmen RBD (RBD) SARS-CoV-2 rekombinan yang diimobilisasi untuk
inkubasi.Selama inkubasi 30 menit, antibodi spesifik RBD di kalibrator, QC dan
sampel akan bersaing dengan hACE2-HRP untuk mengikat RBD secara spesifik yang diimobilisasi di dalam sumur.Setelah
inkubasi, sumur dicuci 4 kali untuk menghilangkan konjugat hACE2-HRP yang tidak terikat.Solusi dari
TMB kemudian ditambahkan dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu kamar, sehingga terjadi perkembangan a
warna biru.Perkembangan warna dihentikan dengan penambahan HCl 1N, dan serapannya terhenti
diukur secara spektrofotometri pada 450 nm.Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan
jumlah enzim yang ada, dan berbanding terbalik dengan jumlah standar yang diuji dengan cara yang sama.
Melalui perbandingan dengan kurva kalibrasi yang dibentuk oleh kalibrator yang disediakan, konsentrasi
antibodi penetralisir dalam sampel yang tidak diketahui kemudian dihitung.
【BAHAN YANG DIPERLUKAN TAPI TIDAK DISEDIAKAN】
1. Air sulingan atau air deionisasi
2. Pipet presisi: 10μL, 100μL,200μL dan 1 mL
3. Ujung pipet sekali pakai
4. Microplate reader mampu membaca serapan pada 450nm.
5. Kertas penyerap
6. Kertas grafik
7. Mixer pusaran atau sejenisnya
【PENGUMPULAN DAN PENYIMPANAN SPESIMEN】
1. Sampel serum dan plasma yang dikumpulkan dalam tabung berisi K2-EDTA dapat digunakan untuk kit ini.
2. Spesimen harus ditutup rapat dan dapat disimpan hingga 48 jam pada suhu 2 °C - 8 °C sebelum pengujian.
Spesimen yang disimpan dalam waktu lebih lama (hingga 6 bulan) sebaiknya dibekukan hanya sekali pada suhu -20 °C sebelum pengujian.
Hindari siklus pembekuan-pencairan yang berulang.
PROTOKOL
【Persiapan Reagen】
1. Semua reagen harus dikeluarkan dari lemari es dan dibiarkan kembali ke suhu kamar sebelum digunakan
(20° hingga 25°C).Simpan semua reagen di lemari es segera setelah digunakan.
2. Semua sampel dan kontrol harus divorteks sebelum digunakan.
3. Persiapan Solusi hACE2-HRP: Encerkan konsentrat hACE2-HRP dengan perbandingan pengenceran 1:51 dengan Pengenceran
Penyangga.Misalnya, encerkan 100 μL konsentrat hACE2-HRP dengan 5,0mL HRP Dilution Buffer hingga
membuat solusi hACE2-HRP.
4. Persiapan Larutan Pencuci 1×: Encerkan Larutan Pencuci 20× dengan air deionisasi atau air sulingan dengan a
rasio volume 1:19.Misalnya, encerkan 20 mL Larutan Pencuci 20× dengan 380 mL deionisasi atau
air suling untuk membuat 400 mL 1× Larutan Pencuci.
【Prosedur pengetesan】
1. Dalam tabung terpisah, alikuot 120μL Larutan hACE2-HRP yang telah disiapkan.
2. Tambahkan 6 μL kalibrator, sampel yang tidak diketahui, kontrol kualitas di setiap tabung dan aduk rata.
3. Pindahkan 100μL setiap campuran yang disiapkan pada langkah 2 ke dalam lubang pelat mikro yang sesuai
ke konfigurasi pengujian yang telah dirancang sebelumnya.
3. Tutup piring dengan Plate Sealer dan inkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit.
4. Lepaskan Plate Sealer dan cuci piring dengan kira-kira 300 μL 1× Wash Solution per sumur selama empat kali.
5. Ketuk piring di atas tisu untuk menghilangkan sisa cairan di dalam lubang setelah langkah pencucian.
6. Tambahkan 100 μL Larutan TMB ke setiap sumur dan inkubasi cawan dalam tempat gelap pada suhu 20 - 25°C selama 20 menit.
7. Tambahkan 50 μL Stop Solution ke setiap sumur untuk menghentikan reaksi.
8. Baca absorbansi dalam microplate reader pada 450 nm dalam waktu 10 menit (630nm sebagai aksesori
direkomendasikan untuk kinerja presisi yang lebih tinggi).
