SARS-CoV-2 չեզոքացնող հակամարմինների հայտնաբերման հավաքածու (ELISA)
【ՍԿԶԲՈՒՆՔ】
SARS-CoV-2 չեզոքացնող հակամարմինների հայտնաբերման հավաքածուն հիմնված է մրցակցային ELISA մեթոդաբանության վրա:
Օգտագործելով մաքրված ընկալիչի կապող տիրույթը (RBD), վիրուսային հասկի (S) սպիտակուցի և ընդունող բջիջի սպիտակուցը
ACE2 ընկալիչ, այս թեստը նախատեսված է նմանակելու վիրուս-հյուրընկալող չեզոքացնող փոխազդեցությունը:
Կալիբրատորները, Որակի վերահսկիչները և շիճուկի կամ պլազմայի նմուշները առանձին-առանձին լավ խառնվում են նոսրացման մեջ
hACE2-HRP կոնյուգատ պարունակող բուֆեր՝ տրված փոքր խողովակներում:Այնուհետև խառնուրդները տեղափոխվում են ներս
միկրոափսե հորեր, որոնք պարունակում են անշարժացված ռեկոմբինանտ SARS-CoV-2 RBD բեկոր (RBD)
ինկուբացիա.30 րոպեանոց ինկուբացիայի ընթացքում RBD հատուկ հակամարմինները կալիբրատորներում, QC և
նմուշները կմրցեն hACE2-HRP-ի հետ հորերում անշարժացված RBD-ի հատուկ կապակցման համար:հետո
Ինկուբացիայի ընթացքում հորերը լվանում են 4 անգամ՝ չկապված hACE2-HRP կոնյուգատը հեռացնելու համար:-ի լուծում
Այնուհետև ավելացվում է TMB և ինկուբացվում է սենյակային ջերմաստիճանում 20 րոպե, ինչի արդյունքում առաջանում է a
կապույտ գույն.Գույնի զարգացումը դադարեցվում է 1N HCl-ի ավելացմամբ, և կլանում է
չափված սպեկտրոֆոտոմետրիկ եղանակով 450 նմ:Ձևավորված գույնի ինտենսիվությունը համաչափ է
ներկա ֆերմենտի քանակությունը և հակադարձորեն կապված է նույն կերպ վերլուծված ստանդարտների քանակի հետ:
Համեմատության միջոցով տրամաչափման կորի հետ, որը ձևավորվել է տրամադրված չափաբերիչներով, կոնցենտրացիան
Այնուհետև հաշվարկվում են չեզոքացնող հակամարմինները անհայտ նմուշում:
【ՆՅՈՒԹԵՐԸ ՊԱՀԱՆՋՎՈՒՄ ԵՆ, ԲԱՅՑ ՉԵՆ ՏՐԱՄԱԴՐՎՈՒՄ】
1. Թորած կամ դեիոնացված ջուր
2. Ճշգրիտ պիպետներ՝ 10μL, 100μL, 200μL և 1 mL
3. Միանգամյա օգտագործման պիպետտի ծայրեր
4. Microplate reader-ը, որն ունակ է կարդալու կլանումը 450 նմ-ով:
5. Ներծծող թուղթ
6. Գրաֆիկական թուղթ
7. Vortex խառնիչ կամ համարժեք
【ՆՄԱՆՆԵՐԻ ՀԱՎԱՔՈՒՄ ԵՎ ՊԱՀՊԱՆՈՒՄ】
1. K2-EDTA պարունակող խողովակներում հավաքված շիճուկի և պլազմայի նմուշները կարող են օգտագործվել այս փաթեթի համար:
2. Նմուշները պետք է փակվեն գլխարկով և կարող են պահվել մինչև 48 ժամ 2 °C - 8 °C ջերմաստիճանում մինչև փորձարկումը:
Փորձանմուշները, որոնք պահվում են ավելի երկար ժամանակ (մինչև 6 ամիս) պետք է սառեցվեն միայն մեկ անգամ մինչև վերլուծությունը -20 °C ջերմաստիճանում:
Խուսափեք սառեցման-հալման կրկնվող ցիկլերից:
ԱՐՁԱՆԱԳՐՈՒԹՅՈՒՆ
【Ռեագենտի պատրաստում】
1. Բոլոր ռեակտիվները պետք է հանել սառնարանից և օգտագործելուց առաջ թողնել սենյակային ջերմաստիճանի
(20°-ից 25°C):Օգտագործելուց հետո բոլոր ռեակտիվները անմիջապես պահեք սառնարանում:
2. Օգտագործելուց առաջ բոլոր նմուշները և հսկիչ սարքերը պետք է պտտվեն:
3. hACE2-HRP լուծույթի պատրաստում. նոսրացնել hACE2-HRP խտանյութը նոսրացման 1:51 հարաբերակցությամբ նոսրացումով:
Բուֆեր.Օրինակ՝ նոսրացրեք 100 մկլ hACE2-HRP խտանյութ 5.0 մլ HRP նոսրացման բուֆերի հետ։
պատրաստել hACE2-HRP լուծում:
4. 1× Լվացքի լուծույթի պատրաստում. 20× Լվացքի լուծույթը նոսրացրեք դեիոնացված կամ թորած ջրով
ծավալի հարաբերակցությունը 1:19:Օրինակ՝ նոսրացրեք 20 մլ 20× Լվացքի լուծույթը 380 մլ դեիոնացված կամ
թորած ջուր 400 մլ 1× Լվացքի լուծույթ ստանալու համար:
【Փորձարկման ընթացակարգ】
1. Առանձին խողովակներում բաժանեք 120 μL պատրաստված hACE2-HRP լուծույթը:
2. Յուրաքանչյուր խողովակի մեջ ավելացրեք 6 մկլ տրամաչափեր, անհայտ նմուշներ, որակի հսկիչներ և լավ խառնեք:
3. Քայլ 2-ում պատրաստված յուրաքանչյուր խառնուրդից 100 μL տեղափոխեք համապատասխան միկրոափսե հորեր՝ ըստ.
նախապես նախագծված թեստային կոնֆիգուրացիա:
3. Թիթեղը փակեք Plate Sealer-ով և 30 րոպե ինկուբացրեք 37°C-ում:
4. Հեռացրեք ափսեի կնքումը և լվացեք ափսեը մոտավորապես 300 μL 1× Լվացքի լուծույթով չորս անգամ:
5. Հպեք ափսեը թղթե սրբիչի վրա՝ լվանալու քայլերից հետո հորերի մնացորդային հեղուկը հեռացնելու համար:
6. Յուրաքանչյուր ջրհորի մեջ ավելացրեք 100 մկլ TMB լուծույթ և 20 րոպե ինկուբացրեք թիթեղը 20 - 25°C ջերմաստիճանում:
7. Ռեակցիան դադարեցնելու համար յուրաքանչյուր հորին ավելացրեք 50 μL Stop Solution:
8. Կարդացեք ներծծումը 450 նմ 10 րոպեի ընթացքում (630 նմ որպես լրասարք
խորհուրդ է տրվում ավելի բարձր ճշգրտության կատարման համար):
