SARS-CoV-2 semlegesítő antitest-észlelő készlet (ELISA)
【ALAPELV】
A SARS-CoV-2 semlegesítő antitest-észlelő készlet kompetitív ELISA módszertanon alapul.
Tisztított receptorkötő domén (RBD), a vírustüske (S) fehérjéből és a gazdasejtből származó fehérje felhasználásával
ACE2 receptor, ezt a tesztet úgy tervezték, hogy utánozza a vírus-gazdaszervezet neutralizáló kölcsönhatást.
A kalibrátorokat, a minőségellenőrzéseket és a szérum- vagy plazmamintákat egyenként jól összekeverik a hígításban
hACE2-HRP konjugátumot tartalmazó puffer kis csövekben aliquotban. Ezután a keverékeket átvisszük
az immobilizált rekombináns SARS-CoV-2 RBD fragmentumot (RBD) tartalmazó mikrolemez-lyukak
inkubáció. A 30 perces inkubáció során az RBD-specifikus antitest a kalibrátorokban, a QC ill.
a minták versengenek a hACE2-HRP-vel a lyukakban rögzített RBD specifikus megkötéséért. Után
Az inkubálás után a lyukakat négyszer mossuk, hogy eltávolítsuk a meg nem kötött hACE2-HRP konjugátumot. Megoldás a
Ezután TMB-t adunk hozzá, és 20 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, aminek eredményeként a
kék szín. A színfejlődést 1 N HCl hozzáadásával leállítjuk, és az abszorbancia megszűnik
spektrofotometriásan mérve 450 nm-en. A képződött szín intenzitása arányos a
a jelenlévő enzim mennyisége, és fordított arányban áll az azonos módon vizsgált standardok mennyiségével.
A szállított kalibrátorok által alkotott kalibrációs görbével való összehasonlítás révén a koncentráció a
ezután kiszámítjuk az ismeretlen mintában lévő semlegesítő antitestek mennyiségét.
【SZÜKSÉGES ANYAGOK, DE NEM SZÜKSÉGESEK】
1. Desztillált vagy ionmentesített víz
2. Precíziós pipetták: 10μL, 100μL, 200μL és 1 ml
3. Eldobható pipettahegyek
4. Mikrolemez-leolvasó, amely képes leolvasni az abszorbanciát 450 nm-en.
5. Nedvszívó papír
6. Grafikonpapír
7. Vortex keverő vagy azzal egyenértékű
【MINTAVÉTEL ÉS TÁROLÁS】
1. A K2-EDTA-t tartalmazó csövekben gyűjtött szérum és plazma minták használhatók ehhez a készlethez.
2. A mintákat le kell fedni, és a vizsgálat előtt 48 órán keresztül 2 °C – 8 °C között tárolható.
A hosszabb ideig (legfeljebb 6 hónapig) tárolt mintákat a vizsgálat előtt csak egyszer szabad lefagyasztani -20 °C-on.
Kerülje az ismételt fagyasztási-olvadási ciklusokat.
JEGYZŐKÖNYV
【Reagens előkészítése】
1. Használat előtt minden reagenst ki kell venni a hűtőből, és hagyni kell szobahőmérsékletűre melegedni
(20-25 °C). Használat után azonnal tároljon minden reagenst a hűtőszekrényben.
2. Minden mintát és kontrollt használat előtt vortexelni kell.
3. A hACE2-HRP oldat elkészítése: a hACE2-HRP koncentrátumot 1:51 hígítási arányban hígítsa a Hígítással
Puffer. Például hígítson fel 100 μL hACE2-HRP koncentrátumot 5,0 ml HRP hígítópufferrel
készítsünk hACE2-HRP oldatot.
4. 1× mosóoldat elkészítése: Hígítsa fel a 20× mosóoldatot ionmentesített vagy desztillált vízzel
térfogatarány 1:19. Például hígítson fel 20 ml 20-szoros mosóoldatot 380 ml ionmentesített ill.
desztillált vízzel, hogy 400 ml 1×-es mosóoldatot kapjunk.
【Tesztelési eljárás】
1. Külön kémcsövekben aliquot 120 μL-t az elkészített hACE2-HRP oldatból.
2. Adjon hozzá 6 μL kalibrátort, ismeretlen mintákat, minőségellenőrzést minden csőbe, és jól keverje össze.
3. Töltsön át 100 μL-t a 2. lépésben elkészített keverékekből a megfelelő mikrolemez-lyukakba
előre megtervezett tesztkonfigurációra.
3. Fedje le a lemezt Plate Sealer-rel, és inkubálja 37 °C-on 30 percig.
4. Távolítsa el a lemezzárót, és mossa le a lemezt körülbelül 300 μL 1×-es mosóoldattal lyukanként négyszer.
5. Ütögessük a tányért a papírtörlőre, hogy a mosási lépések után eltávolítsuk a lyukakban lévő maradék folyadékot.
6. Adjon 100 μL TMB oldatot minden lyukba, és inkubálja a lemezt sötétben 20-25°C-on 20 percig.
7. Adjon 50 μL leállító oldatot minden mérőhelyhez a reakció leállításához.
8. Olvassa le az abszorbanciát a mikrolemez-leolvasóban 450 nm-en 10 percen belül (630 nm, mint tartozék
nagyobb pontosságú teljesítmény érdekében ajánlott).