Komplet za detekciju neutralizirajućih antitijela SARS-CoV-2 (ELISA)
【NAČELO】
Komplet za otkrivanje neutralizirajućih protutijela SARS-CoV-2 temelji se na kompetitivnoj ELISA metodologiji.
Upotrebom pročišćene receptorske vezne domene (RBD), proteina iz proteina virusnog šiljka (S) i stanice domaćina
receptora ACE2, ovaj je test osmišljen kako bi oponašao neutralizirajuću interakciju virus-domaćin.
Kalibratori, kontrole kvalitete i uzorci seruma ili plazme pojedinačno se dobro miješaju u razrjeđenju
pufer koji sadrži hACE2-HRP konjugat alikvotiran u malim epruvetama.Zatim se smjese prebacuju
jažice mikropločice koje sadrže imobilizirani rekombinantni SARS-CoV-2 RBD fragment (RBD) za
inkubacija.Tijekom 30-minutne inkubacije, RBD specifična antitijela u kalibratorima, QC i
uzorci će se natjecati s hACE2-HRP za specifično vezanje RBD-a imobiliziranog u jažicama.Nakon
Tijekom inkubacije, jažice se isperu 4 puta da se ukloni nevezani hACE2-HRP konjugat.Rješenje od
Zatim se doda TMB i inkubira 20 minuta na sobnoj temperaturi, što rezultira razvojem a
plava boja.Dodatkom 1N HCl zaustavlja se razvoj boje, a apsorbancija se
mjereno spektrofotometrijski na 450 nm.Intenzitet nastale boje proporcionalan je
količina prisutnog enzima, i obrnuto je proporcionalna količini standarda testiranih na isti način.
Usporedbom s kalibracijskom krivuljom koju su izradili isporučeni kalibratori, koncentracija
zatim se izračunavaju neutralizirajuća protutijela u nepoznatom uzorku.
【MATERIJALI POTREBNI, ALI NISU OBAVEZENI】
1. Destilirana ili deionizirana voda
2. Precizne pipete: 10 μL, 100 μL, 200 μL i 1 mL
3. Jednokratni vrhovi za pipete
4. Čitač mikroploča koji može očitati apsorbanciju na 450 nm.
5. Upijajući papir
6. Grafički papir
7. Vortex mikser ili ekvivalent
【SKUPLJANJE I ČUVANJE UZORAKA】
1. Uzorci seruma i plazme prikupljeni u epruvetama koje sadrže K2-EDTA mogu se koristiti za ovaj komplet.
2. Uzorke treba zatvoriti i mogu se čuvati do 48 sati na 2 °C - 8 °C prije analize.
Uzorci koji se čuvaju dulje vrijeme (do 6 mjeseci) trebaju se zamrznuti samo jednom na -20 °C prije analize.
Izbjegavajte ponovljene cikluse smrzavanja i odmrzavanja.
PROTOKOL
【Priprema reagensa】
1. Sve reagense potrebno je izvaditi iz hladnjaka i ostaviti da se vrate na sobnu temperaturu prije upotrebe
(20° do 25°C).Spremite sve reagense u hladnjak odmah nakon upotrebe.
2. Sve uzorke i kontrole treba promućkati prije upotrebe.
3. Priprema otopine hACE2-HRP: Razrijedite koncentrat hACE2-HRP u omjeru razrjeđenja 1:51 s Razrjeđivanjem
Pufer.Na primjer, razrijedite 100 μL koncentrata hACE2-HRP s 5,0 mL pufera za razrjeđivanje HRP-a kako biste
napravite otopinu hACE2-HRP.
4. Priprema 1× otopine za ispiranje: razrijedite 20× otopinu za ispiranje s deioniziranom ili destiliranom vodom s
omjer volumena 1:19.Na primjer, razrijedite 20 mL 20× otopine za ispiranje s 380 mL deionizirane ili
destilirane vode da se dobije 400 mL 1× otopine za ispiranje.
【Procedura ispitivanja】
1. U zasebne epruvete alikvotirajte 120 μL pripremljene otopine hACE2-HRP.
2. Dodajte 6 μL kalibratora, nepoznatih uzoraka, kontrola kvalitete u svaku epruvetu i dobro promiješajte.
3. Prenesite 100 μL svake smjese pripremljene u koraku 2 u odgovarajuće jažice mikropločice prema
na unaprijed dizajniranu ispitnu konfiguraciju.
3. Pokrijte ploču sredstvom za zatvaranje ploča i inkubirajte na 37°C 30 minuta.
4. Uklonite zatvarač ploče i četiri puta operite ploču s približno 300 μL 1× otopine za ispiranje po jažici.
5. Lupnite ploču o papirnati ručnik kako biste uklonili zaostalu tekućinu u jažicama nakon koraka pranja.
6. Dodajte 100 μL TMB otopine u svaku jažicu i inkubirajte ploču u mraku na 20 - 25°C 20 minuta.
7. Dodajte 50 μL otopine za zaustavljanje u svaku jažicu kako biste zaustavili reakciju.
8. Očitajte apsorbanciju u čitaču mikropločica na 450 nm unutar 10 minuta (630 nm kao dodatak
preporučuje se za veću preciznost).
