SARS-CoV-2 न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी डिटेक्शन किट (एलिसा)
【सिद्धांत】
SARS-CoV-2 न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी डिटेक्शन किट प्रतिस्पर्धी एलिसा पद्धति पर आधारित है।
शुद्ध रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी), वायरल स्पाइक (एस) प्रोटीन और मेजबान कोशिका से प्रोटीन का उपयोग करना
रिसेप्टर ACE2, यह परीक्षण वायरस-होस्ट न्यूट्रलाइज़िंग इंटरैक्शन की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
अंशशोधक, गुणवत्ता नियंत्रण, और सीरम या प्लाज्मा नमूने व्यक्तिगत रूप से तनुकरण में अच्छी तरह मिश्रित होते हैं
बफर युक्त hACE2-HRP संयुग्म को छोटी ट्यूबों में विभाजित किया जाता है।फिर मिश्रण को अंदर स्थानांतरित कर दिया जाता है
माइक्रोप्लेट कुओं में स्थिर पुनः संयोजक SARS-CoV-2 RBD टुकड़ा (RBD) होता है
ऊष्मायन.30 मिनट के ऊष्मायन के दौरान, अंशशोधक, क्यूसी और में आरबीडी विशिष्ट एंटीबॉडी
नमूने कुओं में स्थिर आरबीडी को विशिष्ट बाइंडिंग के लिए एचएसीई2-एचआरपी के साथ प्रतिस्पर्धा करेंगे।बाद
ऊष्मायन, अनबाउंड hACE2-HRP संयुग्म को हटाने के लिए कुओं को 4 बार धोया जाता है।का एक समाधान
इसके बाद टीएमबी मिलाया जाता है और कमरे के तापमान पर 20 मिनट तक इनक्यूबेट किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक का विकास होता है
नीला रंग।1एन एचसीएल मिलाने से रंग का विकास रुक जाता है और अवशोषण रुक जाता है
450 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिकल रूप से मापा गया।बनने वाले रंग की तीव्रता के समानुपाती होती है
मौजूद एंजाइम की मात्रा, और उसी तरह परखे गए मानकों की मात्रा से विपरीत रूप से संबंधित है।
प्रदान किए गए अंशशोधकों द्वारा गठित अंशांकन वक्र के साथ तुलना के माध्यम से, की एकाग्रता
फिर अज्ञात नमूने में एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने की गणना की जाती है।
【सामग्री की आवश्यकता है लेकिन उपलब्ध नहीं करायी गयी】
1. आसुत या विआयनीकृत जल
2. परिशुद्धता पिपेट: 10μL, 100μL, 200μL और 1 mL
3. डिस्पोजेबल पिपेट युक्तियाँ
4. माइक्रोप्लेट रीडर 450 एनएम पर अवशोषण को पढ़ने में सक्षम है।
5. अवशोषक कागज
6. ग्राफ पेपर
7. भंवर मिक्सर या समकक्ष
【नमूना संग्रह और भंडारण】
1. K2-EDTA युक्त ट्यूबों में एकत्र किए गए सीरम और प्लाज्मा नमूनों का उपयोग इस किट के लिए किया जा सकता है।
2. नमूनों को छायांकित किया जाना चाहिए और परख से पहले 2 डिग्री सेल्सियस - 8 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे तक संग्रहीत किया जा सकता है।
लंबे समय (6 महीने तक) के लिए रखे गए नमूनों को परख से पहले केवल एक बार -20 डिग्री सेल्सियस पर जमाया जाना चाहिए।
बार-बार जमने-पिघलने के चक्र से बचें।
शिष्टाचार
【अभिकर्मक तैयारी】
1. सभी अभिकर्मकों को प्रशीतन से बाहर निकाला जाना चाहिए और उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर वापस आने दिया जाना चाहिए
(20° से 25°C).उपयोग के तुरंत बाद सभी अभिकर्मकों को रेफ्रिजरेटर में सुरक्षित रखें।
2. उपयोग से पहले सभी नमूनों और नियंत्रणों को भँवरित किया जाना चाहिए।
3. एचएसीई2-एचआरपी समाधान तैयार करना: एचएसीई2-एचआरपी सांद्रण को 1:51 तनुकरण अनुपात पर तनुकरण के साथ पतला करें
बफ़र.उदाहरण के लिए, HACE2-HRP सांद्रण के 100 μL को 5.0mL HRP डाइल्यूशन बफर के साथ पतला करें
एक hACE2-HRP समाधान बनाएं।
4. 1× वॉश सॉल्यूशन तैयार करना: 20× वॉश सॉल्यूशन को विआयनीकृत या आसुत जल के साथ पतला करें
1:19 का आयतन अनुपात।उदाहरण के लिए, 20× वॉश सॉल्यूशन के 20 एमएल को 380 एमएल विआयनीकृत या के साथ पतला करें
400 एमएल 1× वॉश घोल बनाने के लिए आसुत जल।
【परीक्षण प्रक्रिया】
1. अलग-अलग ट्यूबों में, तैयार hACE2-HRP सॉल्यूशन का 120μL एलिकोट करें।
2. प्रत्येक ट्यूब में 6 μL अंशशोधक, अज्ञात नमूने, गुणवत्ता नियंत्रण जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं।
3. चरण 2 में तैयार किए गए प्रत्येक मिश्रण के 100μL को संबंधित माइक्रोप्लेट कुओं में स्थानांतरित करें
पूर्व-डिज़ाइन किए गए परीक्षण कॉन्फ़िगरेशन के लिए।
3. प्लेट को प्लेट सीलर से ढकें और 30 मिनट के लिए 37°C पर इनक्यूबेट करें।
4. प्लेट सीलर को हटा दें और प्लेट को लगभग 300 μL 1× वॉश सॉल्यूशन से चार बार धोएं।
5. कदम धोने के बाद कुओं में बचे हुए तरल पदार्थ को निकालने के लिए प्लेट को कागज़ के तौलिये पर थपथपाएँ।
6. प्रत्येक कुएं में 100 μL टीएमबी सॉल्यूशन डालें और प्लेट को 20 - 25 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अंधेरे में रखें।
7. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रत्येक कुएं में 50 μL स्टॉप सॉल्यूशन डालें।
8. 10 मिनट के भीतर 450 एनएम पर माइक्रोप्लेट रीडर में अवशोषण पढ़ें (सहायक उपकरण के रूप में 630 एनएम)
उच्च परिशुद्धता प्रदर्शन के लिए अनुशंसित)।
